Chotimah, Choirunil (2014) Protein α-S2 Casein Susu Kambing Peranakan Etawah sebagai Antioksidan pada Sel Preosteoblas yang Dipapar dengan Methylglyoxal. Magister thesis, Universitas Brawijaya.
Abstract
Tulang merupakan jaringan yang dinamis dan mengalami pembentukan secara berurutan dan terkoordinasi. Penderita osteoporosis mempunyai karakteristik tulang dengan massa yang rendah, kekuatan menurun dan kerusakan mikroarsitektur karena terjadi penurunan pembentukan tulang baru, penurunan jumlah dan aktifitas osteoblas sehingga beresiko tinggi terjadi fraktur tulang. Penelitian ini bertujuan untuk m enganalisis efek protein α -S2 Casein (CSN1S2) pada sel preosteoblas MC3T3E1 yang dipapar Methylglyoxal (MG) terhadap penurunan ekspresi ROS dan MDA. Menganalisis viabilitas, proliferasi dan diferensiasi sel preosteoblas MC3T3E1 yang dipapar dengan MG dan diberi protein CSN1S2 dari susu kambing Etawah. Penelitian dilakukan dengan isolasi protein CSN1S2 dari susu kambing PE dengan elektroforesis SDS-PAGE. Gel dipotong pada berat molekul 36 kDa kemudian dilakukan elektroelusi. Sel preosteoblas yang dipakai adalah sel preosteoblas MC3T3E1 sub clone 4 dari American Type Culture Cell . Sel preosteoblas ditumbuhkan dengan media komplet alpha-MEM, 2mM L-glutamin, 1mM sodium piruvat, 10% FBS dan 10% Penstrep di dalam botol flask 25 cm 2 dan diinkubasi di dalam inkubator CO 2 5% suhu 37 o C. Sel dipapar dengan MG 5μM selama 6 jam dan diperlakukan dengan protein CSN1S2 susu kambing dengan dosis 25, 50, 100 μg/ml selama 3 hari. Kemudian untuk mengukur intensitas ROS, sel preosteoblas diwarnai dengan 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H 2 DCFDA) 25μM dan diinkubasi 1 jam. Sel dicuci dengan buffer formalin selama 15 menit dan diamati dengan mikroskop Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM, Olympus) selanjutnya dihitung diferensiasi sel. Kemudian dilakukan pengukuran kadar MDA dari supernatan sel. Pengamatan viabilitas dan proliferasi sel preosteoblas dilakukan dengan pewarnaan tryphan blue. Data intensitas ROS, kadar MDA, viabilitas, proliferasi dan diferensiasi sel preosteoblas yang didapatkan dianalisis menggunakan SPSS 16.0 dengan uji beda rata-rata dilakukan dengan uji one-way ANOVA dengan α = 0,05. Hasil penelitian menunjukkan kontrol negatif merupakan sel preosteoblas tanpa perlakuan MG dan protein CSN1S2 memiliki intensitas ekspresi H 2 O 2 yang rendah (486 INT/μm). Kelompok sel normal yang diberi protein CSN1S2 susu kambing PE dengan konsentrasi 25, 50, 100 μg/ml menunjukkan intensitas ekspresi H2O2 dengan nilai sebesar 649, 704, 756 INT/μm. Perlakuan 5μM MG memiliki intensitas ekspresi H 2 O 2 sebesar 1157 INT/μm. Sedangkan intensitas ekspresi H 2 O 2 kelompok 5μM MG yang ditambahkan 25, 50, 100 μg/ml protein CSN1S2 cenderung mengalami penurunan dengan nilai sebesar 627, 741, 742 INT/μm. Pengukuran kadar MDA pada perlakuan 5μM MG sebesar 0,17 mol/L cenderung lebih rendah dari pada perlakuan normal yaitu sebesar 0,23 mol/L. Kadar MDA kelompok MG+CSN1S2 cenderung lebih tinggi bila dibandingkan dengan kelompok normal tetapi tidak berbeda secara signifikan (p0,05). Viabilitas sel yang terendah terdapat pada perlakuan 5μM MG yaitu sebesar 1,6x10 4 sel/ml, sedangkan viabilitas sel tertinggi pada perlakuan 5μM MG+100μg/ml CSN1S2 yaitu 15x10 4 sel/ml. Perlakuan 5μM MG berbeda nyata dengan perlakuan 5μM MG+50μg/ml dan 5μM MG+100μg/ml CSN1S2 (p 0,05). Proliferasi sel cenderung tinggi pada kelompok MG dan MG+CSN1S2, proliferasi sel paling tinggi adalah pada perlakuan 5μM MG+100μg/ml CSN1S2 yaitu sebesar 31,6x10 4 sel/ml. Proliferasi sel terendah adalah pada perlakuan 50 dan 100 μg/ml CSN1S2 yaitu sebesar 10x10 4 sel/ml. Jumlah sel preosteoblas yang mengalami diferensiasi cenderung rendah pada kelompok MG. Hasil uji statistik menunjukkan bahwa proliferasi dan diferensiasi sel preosteoblas pada semua perlakuan tidak berbeda nyata (p0,05). Kesimpulan dari penelitian ini adalah p rotein α -S2 Casein (CSN1S2) berpengaruh terhadap ekspresi ROS dan MDA pada sel preosteoblas MC3T3E1 yang tanpa MG (normal) maupun dipapar MG walaupun tidak terdapat perbedaan yang bermakna. Protein CSN1S2 dosis 50μg/ml dan 100 μg/ml mampu meningkatkan viabilitas sel preosteoblas MC3T3E1 yang dipapar dengan MG, tetapi tidak berpengaruh terhadap proliferasi dan diferensiasi sel preosteoblas.
English Abstract
Bones is a dynamic tissue that subsequently has remodelling. osteoporosis patient has characterized with low of mass bone, decrease of bone strength and damage of bone microarsitecture due to declining a new bone formation and decreasing number and activities of osteoblast. aim of this study is analyzed effect of protein α -S2 Casein (CSN1S2) in preosteoblast cell MC3T3E1 exposed by Methylglyoxal (MG) toward reducing level of ROS and MDA, and also analyzed viability, proliferation, and differentiation of preosteoblast cell MC3T3E1 after exposed by MG and CSN1S2 treatment. Goat PE CSN1S2 protein-purified was electrophoresed by SDS-PAGE 15%, cut 36kDa band and electroeluted overnight, 30 Volt, 90 mA, 4 o C. We used mouse preosteoblast cell culture MC3T3E1 sub clone 4 were purchased from American Type Culture Cell and cultured in complete medium alpha-MEM (Sigma Life Science, USA), 2mM L-glutamine (Gibco, Brazil), 1mM sodium piruvate, 10% FBS (Gibco, USA) and 10% Penicilin streptomisin (Sigma Life science, USA), incubated in CO 2 5%, 37 o C. cells were sub-cultured with trypsin, incubating for 5 minutes and resuspended at a density 2 x 105 cells/mL. Cell at 70-80% confluent were used for experiments. preosteoblast cells sub passage 11 induced by 5 μM Methyl-glyoxal (Sigma Life Science, Germany) for 6 hours n treated with 25, 50, 100 μg/mL CSN1S2 for 3 days. cells were stained with 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H 2 DCFDA) 25μM (Sigma Life Science, Israel) and incubated for 1 hour. Cells were observed under Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM, Olympus) with Olympus FluoView software version 1.7a. number of cell differentiation was counted. proliferation and viability of cell measured by tryphan blue staining and counted with haemocitometer. level of MDA were measured by added 15% Tricholoacetic acid (TCA) and 0,67% Thiobarbituric acid (TBA) in supernatan medium. n vortex solution and boiled with water bath 95 o C. solution was cooled and absorbance was read at 532 nm. statistical test were analyzed using SPSS 16.0 by one way analysis of variance (ANOVA) test, with p 0.05 that indicates a significant differences between groups, and n followed up by a post hoc test if result were significant. result shows cell exposed by 5μM MG has highest intensity expression of H 2 O 2 1157 INT/μm. normal group with CSN1S2 protein 25, 50, 100 μg/ml shows intensity value 649, 704, 756 INT/μm, respectively. negatif control was preosteoblast cell without MG exposure and CSN1S2 protein PE goat milk treatment has low intensity expression of H 2 O 2 (486 INT/ μm). intensity expression of H 2 O 2 in 5μM MG groups with CSN1S2 protein 25, 50, 100 μg/ml was decreased (627, 741, 742 INT/μm, respectively). level of MDA at 5μM MG was 0,17 mol/L lower than normal group (0,23 mol/L). intensity expression of H 2 O 2 and level of MDA has no significant in differences (p0,05). lowest viability of preosteoblast cell was 5μM MG (1,6x10 4 cells/ml) and highest viability was 5μM MG+100μg/ml CSN1S2 (15x10 4 cells/ml). Cells viabilities were significantly lower in 5μM MG (p 0,05). 5μM MG+100μg/ml CSN1S2 and 5μM MG+50μg/ml CSN1S2 significantly increased cells viability compared to MG group (p 0,05). highest cell`s proliferation was 5μM MG+100μg/ml CSN1S2 (31,6x10 4 cells/ml). lowest cell`s proliferation was 50 and 100 μg/ml CSN1S2 (10x10 4 cells/ml). cell`s differentiation was low in MG group but no significantly different compared all groups (p0,05). conclusion of this research were CSN1S2 protein has effect of expression of ROS and MDA in preosteoblast cell. This suggests that CSN1S2 protein dose 50 μg/ml and 100μg/m l able to improve cell viability after exposure to MG. CSN1S2 protein has no effect with cells proliferation and differentiation after exposed with MG.
| Item Type: | Thesis (Magister) |
|---|---|
| Identification Number: | TES/641.371 7/CHO/p/041404577 |
| Subjects: | 600 Technology (Applied sciences) > 641 Food and drink > 641.3 Food |
| Divisions: | S2/S3 > Magister Biologi, Fakultas MIPA |
| Depositing User: | Endro Setyobudi |
| Date Deposited: | 21 Aug 2014 15:57 |
| Last Modified: | 21 Aug 2014 15:57 |
| URI: | http://repository.ub.ac.id/id/eprint/159113 |
Actions (login required)
 |
View Item |