Bioaktivitas Ekstrak Air Daun Ketepeng Cina (Cassia Alata) Terhadap Profil Sel Makrofag Dan Natural Killer Pada Mencit Balb/C Model Diabetes Melitus Gestasional

Prof. Muhaimin Rifa`i, S.Si., Ph.D.Med.Sc and Prof. Dr. Dra. Sri Rahayu, M.Kes (2024) Bioaktivitas Ekstrak Air Daun Ketepeng Cina (Cassia Alata) Terhadap Profil Sel Makrofag Dan Natural Killer Pada Mencit Balb/C Model Diabetes Melitus Gestasional. Sarjana thesis, Universitas Brawijaya.

Abstract

Diabetes melitus gestasional (DMG) merupakan kondisi peningkatan glukosa darah (>200mg/dL) selama kehamilan dan prevalensi selalu meningkat tiap tahunnya. Kondisi DMG disebabkan karena tubuh gagal beradaptasi pada perubahan metabolisme glukosa selama kehamilan. Kadar glukosa darah yang tinggi menstimulus stres oksidatif dan mengganggu keseimbangan sistem imun, seperti perubahan pada aktivitas sel makrofag dan NK. Aktivitas kedua sel ini berperan sebagai immunomodulator untuk memberikan respon proinflamasi atau antiinflamasi selama masa kehamilan. Oleh karena itu, intervensi berupa obat antidiabetes, antioksidan, dan agen antiinflamasi sangat diperlukan untuk mengelola DMG secara efektif. Ekstrak daun ketepeng cina (Cassia alata) telah dilaporkan memiliki kemampuan bioaktif yang relevan, menjadikannya potensi alternatif dalam strategi pengobatan DMG. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis fungsi immunomodulator ketepeng cina (Cassia alata) yang berkaitan dengan aktivitas sel imun makrofag 1 (M1), makrofag 2 (M2) dan natural killer (NK) sebagai modulator inflamasi pada mencit BALB/c model diabetes melitus gestasional. Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan 5 kelompok perlakuan dan 5 ulangan pada setiap kelompok (n=5). Kelompok perlakuan terdiri dari kontrol negatif (normal, mencit hamil tanpa perlakuan), kontrol positif (DMG, mencit hamil dengan kondisi GDM tanpa perlakuan), kontrol obat (metformin, mencit hamil dengan kondisi GDM dan pemberian metformin dosis 307.5 mg/kg BB), serta dua kelompok perlakuan dosis ekstrak daun ketepeng cina (Dosis 1 & Dosis 2, mencit hamil dengan kondisi GDM dan pemberian ekstrak dosis 500mg/kg BB dan 1500mg/kg BB). Hewan coba yang digunakan adalah mencit betina BALB/c umur 8 minggu dalam kondisi hamil dan dimodelkan menjadi mencit DMG melalui injeksi intraperitoneal streptozotocin dan niacinamide. Validasi keberhasilan permodelan ditandai dengan adanya vaginal plug dan kadar glukosa darah >200 mg/dL pada hari ke-6 (Gestasional day/GD 6). Setelah validasi, perlakuan metformin dan ekstrak ketepeng cina diberikan dengan teknik sonde sehari sekali selama 12 hari (GD6 - GD18). Pengukuran berat badan dan gula darah juga dilakukan tiga kali sehari untuk memantau efek perlakuan. Ekstrak daun ketepeng cina diperoleh menggunakan teknik maserasi dengan pelarut air dan dilanjutkan dengan proses freeze drying. Ekstrak dilakukan analisis LCMS untuk screeningix kandungan senyawa ekstrak. Seluruh kelompok mencit dibedah pada hari kehamilan ke-18. Organ hati, pankreas, dan spleen diisolasi dan dilakukan pewarnaan antibodi untuk analisis flowcytometry dengan parameter ekspresi sel NK (NK-TNF-α-IFN-γ dan NK-TGF-β-IL-10), makrofag M1 (CD11b-TNF-α-IL-6), makrofag M2 (CD11b-TGF-β-IL-4.), molekul antioksidan (MDA, SOD, dan NRF2) dan ekspresi sel pankreas (Insulin dan GLPr1). Preparat histologi pankreas diwarnai menggunakan pewarnaan hematoksilin-eosin (H&E) untuk mengamati kondisi dan struktur jaringan pankreas. Jumlah relatif sel dianalisis menggunakan one-way ANOVA dengan nilai p < 0,05 dan uji lanjutan Tukey pada program SPSS 21. Hasil penelitian menunjukan pemberian ekstrak daun ketepeng cina memberikan pengaruh pada penurunan glukosa darah, perubahan ekspresi sel makrofag M1/M2 dan sel NK. Kemampuan ekstrak dalam memberikan pengaruh tersebut disebabkan oleh kandungan senyawa yang dimilikinya. Ekstrak daun ketepeng cina terdeteksi memiliki 36 senyawa dengan kemampuan bioaktif dalam penanganan diabetes mellitus gestasional. Bioaktifitas senyawa ekstrak diketahui memiliki potensi aktivitas antidiabetes, antioksidan, immunomodulator, immunosuppressant, immunostimulant, dan antiinflamasi. Kemampuan aktivitas antidiabetes ekstrak ditunjukan pada data kadar glukosa darah pasca pemberian kedua dosis ekstrak mengalami penurunan mendekati normal dan tidak berbeda signifikan dengan kelompok metformin. Namun, penurunan gula darah secara statistik menunjukan tidak berbeda signifikan dengan dengan kelompok DMG. Aktivitas antidiabetes juga dapat dilihat pada histologi pankreas dan ekspresi insulin pada sel organ pankreas. Pemberian ekstrak mencegah perubahan abnormal dari struktur pankreas islet dan meningkatkan secara signifikan jumlah relatif sel pankreas yang mengekspresikan insulin. Kemudian, kemampuan ekstrak sebagai immunomodulator dievaluasi melalui perubahan jumlah relatif ekspresi sitokin dari sel makrofag dan NK. Dalam kondisi DMG, menunjukan respon penekanan inflamasi dengan jumlah relatif sel makrofag M2 mengalami peningkatan sementara jumlah relatif sel M1 mengalami penurunan. Ekstrak dosis 1 memberikan pengaruh pada peningkatan jumlah relatif sel makrofag M1 dan M2. Sedangkan, ekstrak dosis 2 memberikan pengaruh immunomodulator yang lebih baik dengan mengembalikan jumlah relatif sel makrofag M1 dan M2 mendekati kondisi normal serta menunjukan tidak berbeda signifikan dengan kelompok normal. Selanjutnya pada parameter sel NK, kondisi DMG menunjukan peningkatan jumlah relatif sel NK yang mengekspresikan marker proinflamasi (NK+TNF-α+ dan NK+IFN-γ+) dan antiinflamasi (NK+IL- 10+ dan NK+TGF-β+). Pemberian kedua dosis ekstrak pada kondisi DMG menunjukan adanya penurunan jumlah relatif sel NK yang mengekspresikan proinflamasi dan antiinflamasi. Pemberian ekstrak pada dosis 2 menunjukan efek immunomodulator yang optimal dengan penurunan seluruh marker sel NK mendekati normal atau tidak berbeda signifikan dengan kelompok normal.x Kemampuan antioksidan ekstrak dievaluasi melalui jumlah relatif sel yang mengekspresikan senyawa MDA, enzim SOD dan NRF2 pada organ hati. Pemberian ekstrak pada kedua dosis menunjukan peningkatan mendekati kondisi normal pada jumlah relatif sel yang mengekspresikan NRF2 sebagai jalur transkripsi enzim antioksidan untuk melindungi dari kondisi stress oksidatif. Kemudian, pada kedua kelompok dosis ekstrak menunjukan penurunan jumlah relatif sel yang mengekspresikan SOD sebagai indikator penurunan kadar stress oksidatif. Namun, pada parameter senyawa MDA, dosis 2 menunjukkan peningkatan signifikan pada jumlah relatif sel yang mengekspresikan MDA, yang mengindikasikan ketidakoptimalan dosis 2 dalam mengatasi stres oksidatif. Pemberian ekstrak daun ketepeng cina, khususnya pada dosis 2, menunjukkan potensi sebagai dosis optimal dengan kemampuan mengembalikan jumlah relatif sel NK dan makrofag mendekati kondisi normal, menurunkan kadar glukosa darah, meningkatkan jumlah relatif sel yang mengekspresikan NRF2, dan mencegah perubahan struktur pada pankreas islet. Meskipun demikian, dosis 2 belum mampu secara optimal menurunkan kadar radikal bebas, yang tercermin dari tingginya jumlah reatif sel yang mengekspresikan MDA. Pemberian dosis 500 mg/kg BB berperan dalam meningkatkan ekspresi makrofag, sementara dosis 1500 mg/kg BB lebih efektif dalam mengembalikan ekspresi sel tersebut mendekati kondisi normal. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menentukan rentang dosis optimal guna mencapai efek terapeutik yang maksimal.

English Abstract

Gestational diabetes mellitus (GDM) is a disorder characterized by high blood glucose levels (>200mg/dL) during pregnancy, and its prevalence is increasing annually. GDM occurs due to the body’s failure to adapt to changes in glucose metabolism during pregnancy. High blood glucose levels stimulate oxidative stress and disrupt immune system balance, such as changes in macrophage and NK cell activity. The activity of these cells plays a role as immunomodulators, providing either pro-inflammatory or anti-inflammatory responses during pregnancy. Therefore, interventions involving anti-diabetic, antioxidant, and anti-inflammatory agents are necessary for the effective management of GDM. Candle bush (Cassia alata) leaf extract has been reported to possess relevant bioactive properties, making it a potential alternative in the treatment of GDM. This study aims to analyze the immunomodulatory responds of candle bush related to the activity of macrophage 1 (M1), macrophage 2 (M2), and natural killer (NK) cells as inflammatory modulators in a BALB/c mouse model of gestational diabetes mellitus. This study used a Complete Randomized Design (CRD) with five treatment groups and five repetitions per group (n=5). The treatment groups consisted of a negative control (normal, pregnant mice without any treatment), positive control (GDM, pregnant mice in GDM condition and without any treatment), drug control (metformin, pregnant mice in GDM condition with metformin treatment dose 307.5 mg/kg BW), and two treatment groups with Candle bush leaf extract (dose 1 & dose 2, pregnant mice in GDM condition with extract treatment dose 500 and 1500 mg/kg BW). The experimental animals used were 8-week-old female BALB/c mice, in a pregnant condition, and induced to develop GDM by intraperitoneal injection of streptozotocin and niacinamide. Validation of successful modeling was indicated by the presence of a vaginal plug and blood glucose levels >200 mg/dL on day 6 (Gestational day/GD 6). After validation, metformin and Candle bush extract treatments were administered via oral gavage once daily for 12 days (GD6 - GD18). Body weight and blood glucose were measured three times a day to monitor treatment effects. The Candle bush leaf extract was obtained through maceration using water as the solvent, followed by freeze-drying. The extract was analyzed by LC-MS for screening its compounds. On day 18 of pregnancy, all mice were euthanized. The liver, pancreas, and spleen were isolated, and antibody staining was performedxii for flow cytometry analysis with parameters for NK cell expression (NK-TNF-α-IFN-γ and NKTGF-β-IL-10), M1 macrophages (CD11b-TNF-α-IL-6), M2 macrophages (CD11b-TGF-β-IL-4), antioxidant molecules (MDA, SOD, and NRF2), and pancreatic cell expression (Insulin and GLPr1). Pancreatic histology was stained using Hematoxylin and Eosin (H&E) to observe the condition and structure of pancreatic tissue. Relative cell counts were analyzed using one-way ANOVA with a p-value < 0.05 and Tukey's post hoc test in SPSS 21. The results indicated that the administration of Candle bush leaf extract significantly affected blood glucose levels, changes in M1/M2 macrophage cell expression, and NK cells. The extract’s ability to influence these outcomes is attributed to its bioactive compounds. The extract was found to contain 36 bioactive compounds with potential activity against diabetes, antioxidants, immunomodulators, immunosuppressants, immunostimulants, and anti-inflammatory agents. The anti-diabetic activity of the extract was demonstrated by decrease in blood glucose levels after administration of the both dose extract, approaching normal levels and not significantly different from the metformin group. However, the reduction in blood glucose levels is statistically not significantly different from the DMG group. Anti-diabetic activity was also reflected in pancreatic histology and relative number of pancreatic cells expressing insulin. The extract prevented abnormal changes in pancreatic islet structure and significantly increased insulin expression in pancreatic cells. Immunomodulatory activity was evaluated by changes in relative cytokine expression from macrophage and NK cells. During GDM condition, an anti-inflammatory response was observed by increasing the relative number of M2 macrophages while the relative number of M1 macrophages decreasing. The administration of extract at dose 1 influenced an increase in the relative number of M1 and M2 macrophages. Meanwhile, the extract at dose 2 demonstrated a better immunomodulatory effect by restoring the relative number of M1 and M2 macrophages to near-normal levels, with no significant difference compared to the normal group. Furthermore, in NK cell parameters, the GDM condition showed an increase in the relative number of NK cells expressing pro-inflammatory markers (NK+TNF-α+ and NK+IFN-γ+) and anti-inflammatory markers (NK+IL-10+ and NK+TGF-β+). The administration of both doses of the extract under GDM conditions resulted in a reduction in the relative number of NK cells expressing pro-inflammatory and anti-inflammatory markers. The administration of the extract at dose 2 showed optimal immunomodulatory effects, with a reduction in all NK cell markers approaching normal levels or showing no significant difference from the normal group. The antioxidant potential of the extract was evaluated through the relative number of cells expressing MDA, SOD enzyme, and NRF2 in the liver. Administration of the extract at both doses showed an increase in the relative number of cells expressing NRF2, approaching normal conditions, as a transcriptional pathway forxiii antioxidant enzymes to protect against oxidative stress. Furthermore, both extract dose groups demonstrated a decrease in the relative number of cells expressing SOD, indicating a reduction in oxidative stress levels. However, administration dose 2 showed a significant increase in relative count cells expressing MDA, indicating suboptimal effects in managing oxidative stress. In conclusion, Candle bush leaf extract, particularly at the 1500 mg/kg dose, demonstrated potential as an optimal dose for restoring normal relative count cell of NK and macrophage cell expression, lowering blood glucose levels, increasing NRF2-expressing cells, and preventing pancreatic islet structural changes. However, the 1500 mg/kg dose was not able to optimally reduce free radicals, as indicated by the elevated MDA expression. The 500 mg/kg dose improved macrophage expression, while the 1500 mg/kg dose was more effective at restoring normal expression. Further research is needed to determine the optimal dose range for achieving maximum therapeutic e

Item Type:	Thesis (Sarjana)
Identification Number:	0424090087
Divisions:	S2/S3 > Magister Biologi, Fakultas MIPA
Depositing User:	Unnamed user with username nova
Date Deposited:	05 Feb 2025 08:12
Last Modified:	05 Feb 2025 08:12
URI:	http://repository.ub.ac.id/id/eprint/235811

Text (DALAM MASA EMBARGO) Rizky Senna Samoedra.pdf Restricted to Registered users only Download (4MB)

Actions (login required)

View Item