Profiling Senyawa Aktif Fraksi 49 Ekstrak Metabolit Sekunder Streptomyces Hygroscopicus Subsp. Hygroscopicus Sebagai Antimalaria Menggunakan Liquid Chromatography Mass Spectrometry, Molecular Docking Dan Molecular Dynamic

Ardiyanti, Sawitri Aji and Prof. Dr. dr. Loeki Enggar Fitri, M.Kes, Sp.ParK and Prof. Widodo, S.Si.,M.Si.,Ph.D.Med.Sc (2024) Profiling Senyawa Aktif Fraksi 49 Ekstrak Metabolit Sekunder Streptomyces Hygroscopicus Subsp. Hygroscopicus Sebagai Antimalaria Menggunakan Liquid Chromatography Mass Spectrometry, Molecular Docking Dan Molecular Dynamic. Magister thesis, Universitas Brawijaya.

Abstract

Malaria adalah penyakit yang disebabkan oleh parasit Plasmodium yang ditularkan melalui gigitan nyamuk Anopheles. Indonesia merupakan negara endemis malaria, dengan Plasmodium falciparum dan Plasmodium vivax sebagai spesies yang umum ditemukan. Resistensi obat, terutama terhadap Piperaquine DihydroArtemisinin, menjadi penyebab tingginya angka morbiditas dan mortalitas. Resistensi ini disebabkan oleh mutasi pada situs target obat dan perubahan biokimia pada reseptor obat. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa fraksi 49 dari Streptomyces hygroscopicus Subsp. Hygroscopicus yang efektif sebagai antimalaria dalam uji in vitro. Streptomyces adalah genus bakteri gram positif di tanah yang banyak dipelajari diantara mikroorganisme lain. Streptomyces mampu menghasilkan banyak bioaktif metabolit sekunder yang bermanfaat bagi manusia. Penelitian membuktikan bahwa ekstrak metabolit sekunder Streptomyces hygroscopicus Subsp. Hygroscopicus memiliki efek antimalaria secara in vivo dan in silico. Beberapa fraksi dari hasil fraksinasi pertama ekstrak metabolit sekunder Streptomyces hygroscopicus Subsp. Hygroscopicus pada penelitian sebelumnya menunjukkan penghambatan enzim mitokondria Plasmodium falciparum Malate Quinone Oxidoreductase (PfMQO) secara in vitro. Proses fraksinasi ekstrak metabolit Streptomyces hygroscopicus Subsp. Hygroscopicus pada penelitian ini dilakukan dengan alat BUCHI Reveleris® PREP Purification System yang menghasilkan 60 fraksi. Pemilihan fraksi 49 didasarkan pada penelitian Berajani, 2021 membuktikan efektivitas fraksi 45-49 Streptomyces hygroscopicus Subsp. Hygroscopicus sebagai agen antimalaria efektif dan aman secara in vitro. Berdasarkan hasil penelitian tersebut disimpulkan bahwa fraksi metabolit sekunder S. hygroscopicus nomor fraksi 49 memiliki efek antimalaria yang efektivitasnya menyerupai Artemisinin. Hal ini dibuktikan dengan adanya penurunan jumlah LDH pada kultur P. berghei setelah mendapat paparan fraksi 49 serta berdasarkan hasil pengamatan mikroskopis menunjukkan pengurangan jumlah P. berghei hidup secara signifikan. Tujuan penelitian ini adalah mengidentifikasi senyawa aktif dalam fraksi 49 menggunakan LCMS dan mengevaluasi aktivitas antimalaria melalui studi molecular docking dan molecular dynamic, dengan menilai binding affinity, profil farmakokinetik, interaksi ikatan dan stabilitas serta fleksibilitas dinamika ikatan. Hasil analisis kandungan senyawa aktif dalam fraksi 49 menjadi dasar analisis in silico dan molecular dynamic yang mentarget senyawa aktif kepada protein spesifik Plasmodium falciparum yaitu Plasmodium falciparum Klech 13 (PfK13), Plasmodium falciparum Plasmepsin II (PfPM2) dan Antigen membran apikal Plasmodium falciparum (PfAMA-1). Dari hasil LCMS fraksi 49 ekstrak metabolit Streptomyces hygroscopicus Subsp. Hygroscopicus dari empat puncak tertinggi dianalisis dengan retention time 0–20 menit, ada empat senyawa yang dapat diidentifikasi yaitu Dibutyl phthalate, Dihydroyashabushiketol, Dibenzilamine dan Sedanolide. Analisis in silico dilakukan dengan metode molecular docking menggunakan PfK13, PfPM2 dan PfAMA-1 sebagai target protein. Preparasi target protein dilakukan dengan mengunduh protein dari database Protein Data Bank (PDB) dan senyawa aktif ligan dari PubChem. Dari analisis farmakokinetik menggunakan SwissADME terbukti bahwa keempat senyawa tersebut memenuhi kriteria drug-likeness berdasarakan Lipinski’s rule of five dan dan Veber’s Rule. Hasil penelitian in silico menunjukkan bahwa senyawa Dibutyl phthalate, Dihydroyashabushiketol, Dibenzilamine dan Sedanolide memiliki nilai afinitas ikatan dengan protein PfK13 berturut-turut sebesar -6,4 Kkal/mol, -7,4 Kkal/mol, -6,4 Kkal/mol dan -6,2 Kkal/mol; ikatan keempat senyawa tersebut dengan protein PfPM2 berturut-turut - 5,8 Kkal/mol, -7,1 Kkal/mol, -6,3 Kkal/mol dan -6,0 Kkal/mol; ikatan keempat senyawa tersebut dengan protein PfAMA-1 berturut-turut -5,4 Kkal/mol, -5,5 Kkal/mol, -5,7 Kkal/ol dan -5,7 Kkal/mol. Nilai afinitas ikatan yang dihasilkan hampir sama dengan target protein PfK13, PfPM2 dan PfAMA-1 dengan ligan kontrol secara berturut-turut sebesar -8,1 Kkal/mol, -8,9 Kkal/mol dan -6,8 Kkal/mol. Hasil interaksi ikatan senyawa fraksi 49 ekstrak metabolit Streptomyces hygroscopicus Subsp. Hygroscopicus memiliki ikatan hidrogen dan hidrofobik dengan asam amino yang sama pada ikatan protein target dan ligan kontrol. Dari keempat senyawa yang dianalisis dengan molecular dynamic, hanya senyawa Dihydroyashabushiketol memiliki struktur yang stabil dan dapat mempertahankan posisinya pada protein target PfK13 dan PfAMA-1. Sedangkan pada protein target PfPM2, senyawa Dihydroyashabushiketol stabil pada awal simulasi namun berubah menjadi tidak stabil setelah > 80 ns. Senyawa tersebut membentuk ikatan hidrogen yang stabil pada PfK13, PfPM2 dan PfAMA-1 karena tidak muncul fluktuasi pada asam amino yang sama dengan kontrol. Dengan fluktuasi yang rendah, maka senyawa tersebut memiliki potensi sebagai antagonis terhadap protein target (PfK13, PfPM2 dan PfAMA-1). Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa fraksi 49 ekstrak metabolit Streptomyces hygroscopicus Subsp. Hygroscopicus yang mengandung senyawa aktif yaitu Dibutyl phthalate, Dihydroyashabushiketol, Dibenzilamine dan Sedanolide memiliki potensi sebagai kandidat antimalaria karena afinitias ikatan yang cukup baik. Selain itu, dengan karakteristik ikatan yang cukup kuat pada protein target PfK13, PfPM2 dan PfAMA-1, keempat senyawa tersebut memiliki ikatan hidrogen dan ikatan hidrofobik pada asam amino yang sama dengan protein target dan ligan kontrol. Senyawa Dihydroyashabushiketol merupakan senyawa dengan nilai afinitas ikatan tertinggi dibandingkan senyawa lain pada seluruh protein target. Senyawa tersebut juga menunjukkan struktur yang stabil dan fleksibilitas yang baik terhadap protein target PfK13 dan PfAMA-1, namun tidak pada protein PfPM2. Sehingga, senyawa Dihydroyashabushiketol berpotensi sebagai kandidat antimalaria pada protein target PfK13 dan PfAMA-1. Temuan ini dapat menjadi dasar untuk pengembangan lebih lanjut senyawa-senyawa ini sebagai agen antimalaria p

English Abstract

Malaria is a disease caused by the Plasmodium parasite transmitted through the bite of Anopheles mosquitoes. Indonesia is an endemic country for malaria, with Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax being commonly found species. Drug resistance, especially to DihydroArtemisinin-Piperaquine, is a significant cause of high morbidity and mortality rates. This resistance is attributed to mutations in the drug target sites and biochemical changes in the drug receptor. Previous research indicates that only the 49th fraction of Streptomyces hygroscopicus Subsp. Hygroscopicus is effective as an antimalarial in in vitro tests. Streptomyces is a gram-positive bacterial genus commonly studied among microorganisms found in the soil. Streptomyces is capable of producing numerous bioactive secondary metabolites that are beneficial to humans. Research has demonstrated that the extract of secondary metabolites from Streptomyces hygroscopicus Subsp. Hygroscopicus has antimalarial effects both in vivo and in silico. Certain fractions obtained from the first fractionation of the extract of secondary metabolites from Streptomyces hygroscopicus Subsp. Hygroscopicus in previous studies have shown inhibition of the Plasmodium falciparum Malate Quinone Oxidoreductase (PfMQO) enzyme in vitro. The fractionation process of the metabolite extract from Streptomyces hygroscopicus Subsp. Hygroscopicus in this study was carried out using the BUCHI Reveleris® PREP Purification System, which yielded 60 fractions. Fraction 49 was selected based on research by Berajani et al., 2021, which demonstrated the effectiveness of fractions 45-49 from Streptomyces hygroscopicus Subsp. Hygroscopicus as effective and safe antimalarial agents in vitro. The research concluded that the secondary metabolite fraction of S. hygroscopicus, specifically fraction number 49, exhibited antimalarial effects comparable to Artemisinin. This was evidenced by a reduction in LDH levels in the P. berghei culture after exposure to fraction 49. Microscopic observations also indicated a significant decrease in the number of viable P. berghei. The objective of this research was to identify active compounds in fraction 49 using LCMS and to evaluate antimalarial activity through molecular docking and molecular dynamics studies. The assessment included binding affinity, pharmacokinetic profile, binding interactions, as well as stability and dynamic flexibility of the binding. The results of the analysis of active compound content in fraction 49 served as the basis for in silico analysis and molecular dynamics targeting specific proteins of Plasmodium falciparum, namely Plasmodium falciparum Klech 13 (PfK13), Plasmodium falciparum Plasmepsin II (PfPM2) and Apical membrane antigen of Plasmodium falciparum (PfAMA-1). From the LCMS results of fraction 49 of the secondary metabolite extract from Streptomyces hygroscopicus Subsp. Hygroscopicus, four compounds with the highest peaks were analyzed within a retention time of 0–20 minutes. The identified compounds are Dibutyl phthalate, Dihydroyashabushiketol,xii Dibenzilamine and Sedanolide. In silico analysis was conducted using molecular docking with PfK13, PfPM2 and PfAMA-1 as target proteins. The preparation of target proteins involved downloading proteins from the Protein Data Bank (PDB) and active ligands from PubChem. The pharmacokinetic analysis using SwissADME confirmed that all four compounds meet the drug-likeness criteria based on Lipinski’s rule of five and Veber’s Rule. In silico research results showed that the compounds Dibutyl phthalate, Dihydroyashabushiketol, Dibenzilamine and Sedanolide exhibited binding affinity values with PfK13 at -6.4 Kcal/mol, -7.4 Kcal/mol, -6.4 Kcal/mol, and -6.2 Kcal/mol, respectively. The binding affinities of these compounds with PfPM2 were -5.8 Kcal/mol, -7.1 Kcal/mol, -6.3 Kcal/mol, and -6.0 Kcal/mol, respectively. The binding affinities of these compounds with PfAMA-1 were -5.4 Kcal/mol, -5.5 Kcal/mol, -5.7 Kcal/mol, and -5.7 Kcal/mol, respectively. The binding affinity values were comparable to the control ligands for PfK13, PfPM2 and PfAMA-1, which were -8.1 Kcal/mol, -8.9 Kcal/mol, and -6.8 Kcal/mol, respectively. The binding interaction results of compound fraction 49 from the secondary metabolite extract of Streptomyces hygroscopicus Subsp. Hygroscopicus showed hydrogen and hydrophobic bonds with the same amino acids in the target protein binding as the control ligands. Out of the four compounds analyzed using molecular dynamics, only the Dihydroyashabushiketol compound has a stable structure and can maintain its position on the PfK13 and PfAMA-1 target proteins. However, for the PfPM2 target protein, Dihydroyashabushiketol remained stable initially but became unstable after >80 ns. The compound formed stable hydrogen bonds with PfK13, PfPM2 and PfAMA-1, indicating its potential as an antagonist against the target proteins (PfK13, PfPM2 and PfAMA-1) due to low fluctuations. From this research, it can be concluded that fraction 49 of the secondary metabolite extract from Streptomyces hygroscopicus Subsp. Hygroscopicus, containing active compounds such as Dibutyl phthalate, Dihydroyashabushiketol, Dibenzilamine and Sedanolide, has the potential as an antimalarial candidate due to its sufficiently good binding affinity. Additionally, with strong binding characteristics to the target proteins PfK13, PfPM2 and PfAMA-1, these four compounds exhibit hydrogen and hydrophobic bonds on the same amino acids as the target proteins and control ligands. Dihydroyashabushiketol, having the highest binding affinity among the compounds for all target proteins, demonstrates a stable structure and good flexibility towards the PfK13 and PfAMA-1 target protein. Therefore, Dihydroyashabushiketol has the potential as an antimalarial candidate for the PfK13 and PfAMA-1 target protein. These findings could serve as a basis for further development of these compounds as potential antimalarial agents.

Item Type:	Thesis (Magister)
Identification Number:	0424060105
Divisions:	S2/S3 > Magister Ilmu Biomedis, Fakultas Kedokteran
Depositing User:	Unnamed user with username nova
Date Deposited:	10 Oct 2024 01:27
Last Modified:	10 Oct 2024 01:27
URI:	http://repository.ub.ac.id/id/eprint/231526

Text (DALAM MASA EMBARGO) Sawitri Aji Ardiyanti.pdf Restricted to Registered users only Download (8MB)

Actions (login required)

View Item