Pengembangan Internal Positive Control Spesifik Sus scrofa domesticus Berdasarkan Gen CO1 dengan Metode Kloning untuk Verifikasi Metode Real-Time PCR

Dr. Ir. Joni Kusnadi, M.Si and Prof. Dr. Ir. Estri Laras Arumingtyas, M.Sc.St. (2024) Pengembangan Internal Positive Control Spesifik Sus scrofa domesticus Berdasarkan Gen CO1 dengan Metode Kloning untuk Verifikasi Metode Real-Time PCR. Sarjana thesis, Universitas Brawijaya.

Abstract

Hingga saat ini kasus pemalsuan daging halal menggunakan daging babi masih banyak terjadi di Indonesia dengan alasan ekonomi dan peningkatan keuntungan yang sangat merugikan konsumen dari segi kesehatan dan agama. Salah satu metode untuk mendeteksi kandungan babi yaitu Real-Time PCR yang menggunakan primer spesifik dan lebih sensitif dalam mendeteksi DNA babi. Namun metode Real-Time PCR juga sangat rentan terhadap kontaminasi silang, baik dari komponen non-DNA (protein, lemak, RNA), lingkungan, ataupun kehadiran inhibitor yang dapat menyebabkan amplifikasi tidak akurat. Maka dari itu, dibutuhkan internal positive control (IPC) sebagai kontrol positif yang mengandung DNA target agar nantinya mendapatkan hasil amplifikasi yang lebih akurat. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan IPC spesifik dari spesies babi (Sus scrofa domesticus) berdasarkan sekuen gen cytochrome c oxidase subunit 1 (CO1) melalui metode kloning, kemudian dioptimasi dengan metode Real-Time PCR. Langkah awal yang dilakukan adalah mengekstraksi DNA dari daging babi, lalu diuji konsentrasi dan kemurniannya secara kuantitatif. Kemudian DNA yang memiliki konsentrasi dan kemurnian tinggi diamplifikasi dengan PCR konvensional dan dianalisis secara kualitatif dengan elektroforesis. Produk PCR tersebut dipurifikasi untuk kemudian di kloning dengan kit pGEM-T Easy Vector System. Plasmid rekombinan yang telah dikonfirmasi positif mengandung gen target selanjutnya dipurifikasi dan dijadikan sebagai IPC, lalu dioptimasi secara kuantitatif dengan Real-Time PCR. Hasil penelitian menunjukan bahwa DNA babi yang diekstrak memiliki konsentrasi tinggi yaitu 57,69 – 182,57 ng/μl dengan kemurnian 1,8 – 1,9. Amplifikasi DNA tersebut juga menghasilkan pita tunggal yang tebal dan jelas, serta sesuai ukuran target amplikon primer CO1 yaitu ±137 bp. Setelah produk PCR dipurifikasi, konsentrasinya turun menjadi 77,01 ng/μl. Sementara itu, hasil kloning yang diseleksi dengan blue white screening menujukan adanya koloni putih/biru yang muncul pada cawan reaksi standar. Koloni putih tersebut diambil sebanyak 24 untuk dikonfirmasi dengan PCR koloni dan PCR kultur LB cair, lalu 3 sampel diantaranya diambil untuk dipurifikasi plasmid dan disekuensing. Hasil konfirmasi menunjukan bahwa koloni putih tersebut positif mengandung plasmid rekombinan yang identik dengan Sus scrofa domesticus gen CO1. Hasil optimasi dengan Real-Time PCR menunjukan bahwa IPC dapat diamplifikasi dengan baik pada konsentrasi 18,5 ng/μl dan bersifat stabil, dimana menghasilkan nilai Ct yang rendah dibandingkan sampel DNA lain yaitu 6,32 – 6,62 pada uji spesifistas dan aplikabilitas. IPC ini juga memiliki batas deteksi hingga konsentrasi 10-6 ng/μl dengan linieritas 0,99 dan efisiensi PCR sebesar 103%, dimana angka tersebut sesuai dengan standar uji qPCR. Selain itu, IPC yang dikembangkan tahan terhadap beberapa inhibitor dalam bahan pangan, kecuali EDTA.

English Abstract

Cases of pork counterfeiting still occur until now, frequently for economic reasons and increasing profits, which it is very detrimental to consumers in terms of health and religion. One method for detecting pork content in processed food is PCR which using specific and sensitive primers to detect pork DNA. However, the PCR method is also very susceptible to cross-contamination, either from non-DNA components (protein, fat, RNA), the environment, or the presence of inhibitors which can cause inaccurate amplification results. Therefore, internal positive control (IPC) is needed as a control containing target DNA in order to get more accurate amplification results. This study aims to develop a specific internal positive control (IPC) from the pig species (Sus scrofa domesticus) based on the cytochrome c oxidase subunit 1 (CO1) gene sequence using cloning method, then tested its effectiveness with the Real-Time PCR method. The first step was to extract DNA from pork, then test its concentration and purity quantitatively. Then the DNA with high concentration and purity was amplified by conventional PCR and analyzed qualitatively by electrophoresis. The PCR product was purified and then cloned with the pGEM-T Easy Vector System kit. Recombinant plasmids that have been confirmed positive for the target gene were purified and used as IPCs, then tested quantitatively by Real-Time PCR. The results showed that the extracted pig DNA had a high concentration which around 57.69 - 182.57 ng/μl with a purity of 1.8 - 1.9. The DNA amplification also produced a single band that was thick and clear, and according to the target size of the CO1 primer amplicons, which was ±137 bp. After the PCR product was purified, the concentration dropped to 77.01 ng/μl. Meanwhile, the cloning results selected by blue white screening showed the presence of white/blue colonies that appeared on a standard reaction plate. 24 white colonies were isolated for confirmation by colony PCR and liquid LB culture PCR, and 3 samples were taken for sequencing. Confirmation results showed that the white colonies were positive for recombinant plasmids identical to Sus scrofa domesticus CO1 gene. REAL-TIME PCR testing showed that the IPC could be amplified well at a concentration of 18.5 ng/μl and was stable, which has low Ct value compared to other DNA samples, namely 6.32 - 6.62 in the specificity and applicability assays. This IPC also has a detection limit up to concentration of 10-6 ng/μl with a linearity of 0.99 and a PCR efficiency of 103%, which is in accordance with the qPCR assays standard. In addition, the developed IPC is resistant to several inhibitors in foodstuffs, except EDTA.

Item Type:	Thesis (Sarjana)
Identification Number:	052410
Divisions:	Fakultas Teknologi Pertanian > Keteknikan Pertanian
Depositing User:	soegeng sugeng
Date Deposited:	14 Nov 2024 06:50
Last Modified:	14 Nov 2024 06:50
URI:	http://repository.ub.ac.id/id/eprint/228641

Text (DALAM MASA EMBARGO) Intan Juwita Sukma.pdf Restricted to Registered users only Download (4MB)

Actions (login required)

View Item