Ekstraksi, Purifikasi, dan Karakterisasi Enzim Penisilin G Asilase (PGA) dari Achromobacter xylosoxidans

Bryan, Bryan and Tunjung Mahatmanto,, STP., M.Si and Dr. rer. Nat. Niknik Nurhayati S, .Si., (2024) Ekstraksi, Purifikasi, dan Karakterisasi Enzim Penisilin G Asilase (PGA) dari Achromobacter xylosoxidans. Sarjana thesis, Universitas Brawijaya.

Abstract

Penisilin G Asilase (PGA) merupakan enzim penisilin asilase tipe II yang mampu menghidrolisis Penisilin G menjadi 6-APA dan asam fenilasetat. 6-APA merupakan intermediet untuk produksi antibiotik semisintesis. Salah satu sumber penghasil PGA adalah Achromobacter xylosoxidans, yang merupakan bakteri Gram negatif. Enzim PGA dari A. xylosoxidans (AxPGA) ini terdiri dari subunit α dan subunit β dengan berat molekul masing-masing 27.2 kDa dan 62.7 kDa. Pada penelitian ini, AxPGA diproduksi dari E. coli BL21 (DE3) rekombinan yang membawa plasmid pET28-axpgamut koleksi kelompok riset Rekayasa Protein dan Mikrob untuk Industri Hijau, Pusat Riset Mikrobiologi Terapan BRIN. Produksi Axpga dari E. coli BL21 (DE3) pET28-axpgamut rekombinan dilakukan dengan induksi IPTG 0.5 mM selama 14-16 jam pada suhu 25℃ dengan agitasi 200 rpm. Hasil produksi dipanen dan diekstraksi dengan tiga metode berbeda, yaitu ultrasonikasi, bead beating, dan kejut osmotik untuk mengetahui metode ekstraksi paling optimal. Didapatkan ekstraksi dengan ultrasonikasi menghasilkan total aktivitas enzim tertinggi, yaitu 50.54 U dan aktivitas spesifik 0.171 U/mg, sedangkan ekstraksi dengan bead beating menghasilkan total aktivitas sebesar 6.135 U dengan aktivitas spesifik 0.048 U/mg, dan ekstraksi dengan kejut osmotik tidak menunjukkan adanya aktivitas Axpga. Setelah ekstraksi, dilakukan purifikasi dengan kromatografi interaksi hidrofobik (KIH) menggunakan resin Phenyl Sepharose CL-6B dan Kromatografi Penukaran Ion (KPI) menggunakan resin Q-Sepharose Fast Flow. Pada kromatografi interaksi hidrofobik, sampel hasil ekstraksi dipresipitasi terlebih dahulu dengan metode salting out menggunakan ammonium sulfat hingga kadar garamnya 60%, sedangkan untuk KPI, sampel hanya disaring dengan filter 0.45 μm dan langsung dimuat pada kolom resin. Fraksinasi menggunakan KIH yang dilarutkan dengan buffer fosfat pH 7 0.05 M + 1.13 M menunjukkan hasil yang terbaik, dengan aktivitas spesifik dan kelipatan purifikasi tertinggi, yaitu 2.597 U/mg dan 136.85 kali, dengan aktivitas volumetrik 2.115 U/mL dan yield 28.42%.. Fraksinasi menggunakan KPI menunjukkan hasil terbaik saat dilarutkan dengan buffer Tris-Cl Ph 8 0.05 M + 1 M NaCl dengan aktivitas volumetrik 4.427 U/mL, yield yaitu 35.04%, aktivitas spesifik 6.3 U/mg dan kelipatan purifikasi 63.56 kali. Karakterisasi PGA menunjukkan aktivitas tertinggi pada pH 7 dan suhu 37℃

English Abstract

Penicillin G Acylase (PGA) is a type II penicillin acylase enzyme capable of hydrolyzing Penicillin G into 6-APA and phenylacetic acid. 6-APA is an intermediate for the production of semisynthetic antibiotics. One source of PGA producer is Achromobacter xylosoxidans, which is a Gram-negative bacterium. The PGA enzyme from A. xylosoxidans (AxPGA) consists of α subunit and β subunit with molecular weight of 27.2 kDa and 62.7 kDa, respectively. In this study, AxPGA was produced from recombinant E. coli BL21 (DE3) carrying plasmid pET28-axpgamut transformed on plasmid pET28) in the collection of Protein and Microb Engineering for Green Industry research group, BRIN Applied Microbiology Research Center. AxPGA production from recombinant E. coli BL21 (DE3) pET28-axpgamut was carried out with 0.5 mM IPTG induction for 14-16 hours at 25℃ with 200 rpm agitation. The products were harvested and extracted by three different methods, namely ultrasonication, bead beating, and osmotic shock to determine the most optimal extraction method. Ultrasonication extraction resulted in the highest total enzyme activity of 50.54 U and a specific activity of 0.171 U/mg, while bead beating extraction resulted in a total activity of 6.135 U with a specific activity of 0.048 U/mg, and osmotic shock extraction showed no AxPGA activity. After extraction, purification was carried out by hydrophobic interaction chromatography (HIC) using Phenyl Sepharose CL-6B resin and Ion Exchange Chromatography (IEC) using Q-Sepharose Fast Flow resin. In hydrophobic interaction chromatography, the extracted samples were precibandted first by the salting out method using ammonium sulfate until the salt content was 60%, while for KPI, the samples were only filtered with a 0.45 μm filter and directly loaded on the resin column. Fractionation using KIH dissolved with phosphate buffer pH 7 0.05 M + 1.13 M produced the best result, with specific activity and purification folds of 17,561 U/mg and 136.85 times, and volumetric activity of 7,639 U/mL and yield of 28.42%. Fractionation using KPI showed the best results when dissolved with Tris-Cl Ph 8 buffer 0.05 M + 1 M NaCl with volumetric activity of 4,427 U/mL, yield of 35.04%, specific activity of 6.3 U/mg and purification multiples of 63.56 times. Characterization of PGA showed the highest activity at pH 7 and temperature 37℃

Item Type:	Thesis (Sarjana)
Identification Number:	052410
Divisions:	Fakultas Teknologi Pertanian > Keteknikan Pertanian
Depositing User:	soegeng sugeng
Date Deposited:	14 Nov 2024 03:43
Last Modified:	14 Nov 2024 03:43
URI:	http://repository.ub.ac.id/id/eprint/228617

Text (DALAM MASA EMBARGO) Bryan.pdf Restricted to Registered users only Download (1MB)

Actions (login required)

View Item