Pembuatan Internal Positive Control Spesifik Canis lupus familiaris Berdasarkan Gen COI Menggunakan Metode Kloning untuk Autentikasi Halal dengan Real-Time PCR

Putri, Nazwar Eka and Dr. Ir. Joni Kusnadi, M.Si and Dr. Nur Kusmiyati, S.Si, M.Si. (2024) Pembuatan Internal Positive Control Spesifik Canis lupus familiaris Berdasarkan Gen COI Menggunakan Metode Kloning untuk Autentikasi Halal dengan Real-Time PCR. Sarjana thesis, Universitas Brawijaya.

Abstract

Indonesia merupakan negara dengan mayoritas muslim terbesar kedua di dunia sehingga perlu ditegaskan perlindungan konsumen muslim terkait produk Kata kunci : Canis lupus familiaris, Internal Positive Control (IPC), Kloning, Polymerase Chain Reaction (PCR). pangan halal. Kasus ditemukannya DNA hewan non halal seperti daging anjing pada produk pangan olahan, baik karena kontaminasi maupun adulturasi tidak sesuai dengan UU RI No.3 Tahun 2014 tentang Jaminan Produk Halal. Metode deteksi DNA anjing yang banyak digunakan adalah real-time Polymerase Chain Reaction (PCR). Metode deteksi DNA PCR ini memiliki kekurangan yaitu adanya hambatan uji PCR yang dapat menghasilkan negatif palsu (hasil yang menunjukkan negatif padahal terdapat DNA target atau sebenarnya positif) terhadap hasil tes PCR. Respon negatif palsu disebabkan oleh adanya inhibitor, kesalahan pada proses ekstraksi, dan malfungsi mesin PCR sehingga hasil tes PCR menjadi invalid. Berdasarkan hal tersebut, dikembangkan Internal Positive Control (IPC) spesifik spesies anjing (Canis lupus familiaris) menggunakan sekuens gen Cytochrome c Oxidase Subunit 1 (COI) dengan metode kloning. IPC yang dibuat bertujuan untuk menekan adanya respon negatif palsu, sensitif, spesifik dan tahan terhadap terhadap inhibitor. Penelitan ini dimulai dengan isolasi DNA, amplifikasi menggunakan PCR konvensional, kemudian dilakukan kloning sekuens COI tersebut pada E. coli JM109 , konfirmasi hasil kloning dan instrumentasi IPC/DNA menggunakan real-time PCR. Hasil ekstraksi DNA dari sumber daging anjing memperoleh konsentrasi 90,1 dan 102,8 dengan nilai kemurnian beerturut-turut 1,84 dan 1,87. Hasil ekstraksi tersebut diamplifikasi menggunakan primer spesifik COI dengan hasil pita tunggal yang ditamplikan cukup tebal dengan warna tegas dengan berat molekul 140 bp dimana template tersebut sesuai dengan primer spesifik COI yang digunakan. Selanjutnya, purifikasi pada hasil PCR DNA anjing dengan sekuens COI sebagai DNA insert yang telah ditransformasi diseleksi dan dikonfirmasi dengan PCR. Hasil konfirmasi koloni positif ditunjukkan dengan panjang pita sekuens yang muncul pada berat molekul 140 bp, memiliki pita tunggal yang tebal dan tegas. Kemudian dilakukan uji sekuensing untuk mengkonfirmasi kembali koloni dan dianalisis menggunakan algoritma BLAST dengan hasil persentase homologi berkisar >90%. Hasil uji kinerja IPC menggunakan real-time PCR memiliki sensitivitas yang baik dilihat dari nilai regresi berada pada >0,99 kemudian tahan terhadap inhibitor alginat, selulosa, glukosa, xanthan gum, namun tidak tahan terhadap EDTA. Berdasarkan hasil tersebut, IPC yang telah dirancang telah sesuai dengan ketentuan sensitivitas dan inhibitor

English Abstract

Indonesia is a country with the second largest muslim majority in the world so it is necessary to emphasize the protection of muslim consumers regarding halal food products. The case of the discovery of non-halal animal DNA such as dog meat in processed food products, either due to contamination or adulturation, is not in accordance with RI Law No.3 of 2014 concerning Halal Product Guarantee. The widely used dog DNA detection method is real-time Polymerase Chain Reaction (PCR). This PCR DNA detection method has the disadvantage that there are PCR test barriers that can produce false negatives (results that show negative even though there is target DNA or actually positive) to the PCR test results. False negative responses are caused by the presence of inhibitors, errors in the extraction process, and PCR machine malfunctions so that the PCR test results become invalid. Based on this, a dog species-specific Internal Positive Control (IPC) (Canis lupus familiaris) was developed using the Cytochrome c Oxidase Subunit 1 (COI) gene sequence by cloning method. The IPC made aims to suppress the existence of false negative responses, sensitive, specific and resistant to inhibitors. This research begins with DNA isolation, amplification using conventional PCR, then cloning the COI sequence in E. coli JM109 and confirming the cloning results using real-time PCR. DNA extraction results from dog meat sources obtained concentrations of 90.1 and 102.8 with purity values of 1.84 and 1.87, respectively. The extraction results were amplified using COI-specific primers with the results of a single band that was sampled quite thick with a firm color with a molecular weight of 140 bp where the template was in accordance with the COI-specific primers used. Furthermore, purification of the dog DNA PCR results with COI sequences as DNA inserts that have been transformed were selected and confirmed by PCR. Positive colony confirmation results are indicated by the length of the sequence band that appears at a molecular weight of 140 bp, has a thick and firm single band. Then the sequencing test was carried out to reconfirm the colony and analyzed using the BLAST algorithm with the results of the homology percentage ranging >90%. The results of the IPC performance test using real-time PCR have good sensitivity seen from the regression value at >0.99 then resistant to inhibitors of alginate, cellulose, glucose, xanthan gum, but not resistant to EDTA. Based on these results, the IPC that has been designed is in accordance with the provisions of sensitivity and inhibitors.

Item Type:	Thesis (Sarjana)
Identification Number:	052410
Uncontrolled Keywords:	Canis lupus familiaris, Internal Positive Control (IPC), Kloning, Polymerase Chain Reaction (PCR).
Divisions:	Fakultas Teknologi Pertanian > Keteknikan Pertanian
Depositing User:	Unnamed user with username nova
Date Deposited:	23 Sep 2024 07:14
Last Modified:	23 Sep 2024 07:14
URI:	http://repository.ub.ac.id/id/eprint/225948

Text (DALAM MASA EMBARGO) Nazwar Eka Putri.pdf Restricted to Registered users only Download (3MB)

Actions (login required)

View Item