Respons Imun Seluler dan Protektivitas In Vivo Protein Adhesin Adh036 Salmonella Typhi (Upaya Memperoleh Kandidat Vaksin Demam Tifoid)

Winarsih, Sri and Prof.Drs.Sutiman B.Sumitro, SU.,DSc and Dr. Sanarto Santoso, dr.,SpMK and Dr. Sumarno, dr.,SpMK (2005) Respons Imun Seluler dan Protektivitas In Vivo Protein Adhesin Adh036 Salmonella Typhi (Upaya Memperoleh Kandidat Vaksin Demam Tifoid). Doktor thesis, Universitas Brawijaya.

Abstract

Salmonella typhi (S.typhi) adalah bakteri Gram negatif yang mempunyai kemampuan untuk menginvasi jaringan di luar usus menyebabkan penyakit demam tifoid. Vaksin demam tifoid yang saat ini beredar adalah Ty21a, ViCPS (Vi capsular polyssacharide) dan Inactivated typhoid vaccine. Namun dari hasil evaluasi yang telah dilakukan, vaksin-vaksin tersebut belum menunjukkan hasil yang optimal. Oleh karena itu, masih diperlukan penyempurnaan terhadap vaksin demam tifoid. Kemungkinan materi permukaan bakteri yang disebut adhesin sebagai target untuk pengembangan vaksin mulai banyak diteliti. Pada penelitian terdahulu telah dilaporkan bahwa S.typhi memiliki protein adhesin yang berasal dari Omp dengan berat molekul sekitar 36 kDa can diberi nama Adh036. Vaksin demam tifoid yang ideal adalah diberikan melalui oral (sesuai dengan patomekanisme penyakit), namun kebanyakan antigen protein tidak imunogenik bila diberikan secara oral. Untuk memperbaiki sifat imunogenisitas, protein dikonjugasi dengan ajuvan. ISCOM ( immunostimulating complex ) disebutkan sebagai salah satu innert delivery system yang bersifat ajuvan. ISCOM dapat mengantarkan protein yang dibawanya menjadi antigen eksogen (respons MHC-II) dan antigen endogen (respons MHC-I). Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan bahwa protein adhesin Adh036 S.typhi mampu menginduksi respons imun seluler yang diperankan oleh sel makrofag dan sel T melalui peningkatan variabel-variabel respons imun, yaitu: IL- 12, jumlah sel NK, lgG2a, aktivasi makrofag (respiratory burst, bactehal uptake, mikrobisidal), terbentuknya sel T memori melalui pengamatan reaksi DTH, dan sel TcD8+i , sehingga dapat mencegah terjadinya kolonisasi bakteri pada usus, hepar dan limpa. Sebagai tambahan, juga ingin diketahui karakter protein Adh036 meliputi berat molekul, pengaruh suhu, sifat hemaglutinasi, reaksi SDesifik dengan serum penderita, pewarnaan glikoprotein dan pH isoelektris dari polipeptida penyusunnya. Hasil penelitian ini diharapkan menjadi landasan yang kuat untuk pengembangan vaksin demam tifoid yang aman, efektif, protektif dan mudah cara menggunakannya. Untuk mencapai target penelitian, protein yang menjadi subyek penelitian dikonjugasi dengan ajuvan ISCOM (immunostimulating complex ). Bakteri Salmonella typhi diperoleh dari penderita demam tifoid dari R.S.Dr.Saiful AnwarMalang. Selain protein Adh036, pada penelitian ini juga diukur respons imun seluler yang diinduksi oleh protein dari seluruh bagian sel (whole cell) S.typhi. Penelitian dilakukan dalam 3 tahap, yaitu: karakterisasi protein adhesin Adh036 dan isolasi protein whole cell (wc) dari bakteri S.typhi (Tahap-1), membuktikan kemampuan protein Adh036/ whole cell S.typhi dalam menginduksi respons imun seluler (Tahap-2); dan membuktikan kemampuan protein Adh036/ whole cell S.typhi dalam menghambat invasi sistemik oleh bakteri (Tahap-3). Pada penelitian Tahap-3, juga diukur kadar S-lgA usus karena dapat digunakan untuk membantu menjelaskan fenomena hambatan kolonisasi yang teijadi pada usus maupun organ sistemik.Penelitian Tahap-1 merupakan penelitian eksploratif. Protein Adh036 diperoleh dengan cara ekstraksi outer membrane protein (Omp) menggunakan deterjen Chaps, kemudian dipisahkan protein yang memiliki berat molekul 36 kD menggunakan SDS-PAGE; sedangkan protein whole cell diperoleh dengan cara homogenisasi sel bakteri, diianjutkan pemurnian dengan ammonium sulfat. Penelitian Tahap-2 dan Tahap-3 merupakan penelitian eksperimental pada hewan coba mencit. Mencit dibagi dalam empat kelompok, yaitu kelompok kontrol, perlakuan ISCOM, perlakuan protein Adh036 dan perlakuan protein wc-ISCOM. Preparat protein-ISCOM dibuat sendiri dengan cara mencampur protein, dengan saponin, kholesterol dan fosfatidilkholin. Pada penelitian Tahap-2 imunisasi protein Adh036/ whole cell S.typhi-ISCOM secara intramuskuler (i.m), sedang pada penelitian Tahap-3, imunisasi pada mencit melalui oral (p.o.)• Sebagai bakteri untuk menguji protektivitas protein Adh036/wc digunakan Salmonella typhimurium karena patomekanisme dan gejala penyakit yang ditimbulkan pada mencit mirip dengan demam tifoid yang disebabkan oleh S.typhi pada manusia. Hasil Penelitian Tahap-1 menunjukkan bahwa adhesin Adh036 S.typhi merupakan senyawa glikoprotein yang pada suhu 25°C menunjukkan BM sekitar 74 kD dan pada suhu 95°C mempunyai BM 36 kD. Protein Adh036 S.typhi bersifat menggumpalkan eritrosit marmut, mencit dan eritrosit manusia golongan O dari tidak menggumpalkan eritrosit domba maupun eritrosit manusia golongan A, B, AB. Hal ini menimbulkan pemikiran bahwa individu dengan golongan darah O rentan terhadap infeksi S.typhi. karena di dalam pustaka disebutkan bahwa terdapat homologi reseptor antara eritrosit dengan sel epitel usus. Pada uji respons terhadap serum penderita demam tifoid, protein Adh036 bereaksi spesifik. Hasil ini mengisyaratkan bahwa protein tersebut bersifat imunogenik. Selanjutnya, dengan eiektroforesis dua dimensi diketahui bahwa protein Adh036 S.typhi tersusun dari lima fraksi polipeptida yaitu dua polipeptida mempunyai pH isoelektris sekitar 4-5, dua polipeptida mempunyai pH isolelektris antara 3-4 dan satu polipeptida mempunyai pH isoelektris sekitar 7. Hasil Penelitian Tahap-2. Dengan menggunakan mikroskop elektron, diketahui bahwa protein Adh036/ whole cell yang dikonjugasi ISCOM (Adh036/wcISCOM) memberikan gambaran warna gelap dibagian tengah (menunjukkan molekul protein yang diinsersikan), dikelilingi oleh bagian lebih terang yang dibentuk oleh matriks ISCOM, dengan ukuran partikel antara 40-70 nm. Selanjutnya, pada uji respons imun seluler diperoleh hasil bahwa imunisasi dengan protein Adh036- ISCOM meningkatkan kadar IL-12 yang lebih tinggi (ANOVA, p=0,0001) dibanding perlakuan yang lain Pada uji jumlah sel NK dihasilkan peningkatan jumlah sel NK yang cukup tinggi (rerata perlakuan kontrol = 8, ISCOM = 10,3, Adh036-ISC0M = 159,1, wc-ISCOM = 75,1), namun secara statistik tidak benmakna (7 test, p>0,05) disebabkan koefisien variasi yang sangat besar. Hasil penelitian juga menunjukkan bahwa Adh036-ISC0M meningkatkan secara bermakna kemampuan respiratory burst (ANOVA, p=0,001), bacterial uptake (ANOVA, p=0,0001) dan mikrobisidal (ANOVA, p=0,014). Sehubungan dengan kemampuan bacterial uptake, dapet dibuktikan pula bahwa perlakuan tersebut juga meningkatkan jumlah makrofag yang menangkap bakteri (menjadi fagosit profesional) (T-test, p=0,0001). Respons imun seluler juga dapat dilihat melalui variabel kadar lgG2a, sel TCD8+ dan reaksi DTH. Pada uji kadar lgG2a (ELISA) diperoleh hasil peningkatan yang bermakna (T-test, p=0,0001), juga pada uji jumlah sel TCDS+ (imunositokimia) menunjukkan peningkatan yang bermakna (T-test, p=0,0001). Imunisasi dengan protein Adh036- ISCOM menunjukkan reaksi DTH positif (rerata= 2,17 mm), sedangkan ketiga kelompok perlakuan yang lain menunjukkan reaksi DTH negatif. Hasil Penelitian Tahap-3. Imunisasi protein Adh036-ISC0M melalui oral meningkatkan secara bermakna kadar S-lgA usus (T-test, p=0,005), serta menurunkan secara bermakna jumlah bakteri pada usus, dan pada hepar + limpa (masing-masing: ANOVA, p=0,0001 dan T-test, p=0,016). Terjadinya peningkatan kadar S-lgA tersebut menunjukkan bahwa protein Adh036 iuga meningkatkan respons Th2 (respons imun humoral). Dengan menggunakan uji statistik path analysis, dapat diketahui bahwa peningkatan kadar IL-12 berhubungan secara kuat dengan penurunan jumlah bakteri pada usus, hepar dan limpa (path coefficient = -1,478). Pengaruh tersebut lebih besar disebabkan oleh aktivasi makrofag (path coefficient = -1,268), sedangkan pengaruh S-lgA usus hanya kecil (path coefficient = -0,209). Hasil penelitian terhadap perlakuan protein whole cell bakteri dibanding kontrol dan perlakuan ISCOM, menunjukkan bahwa protein tersebut meningkatkan jumlah sel NK, dan secara bermakna meningkatkan kadar IL-12 (p=0,031), respiratory burst (p=0,016), jumlah sel makrofag yang menjadi fagosit profesional (p=0,001), jumlah sel TCD8+ (p=0,0001), kadar lgG2a (p=0,0001), kadar SlgA usus (p=0,0001), dan menurunkan jumlah bakteri pada usus (p=0,008); sedangkan untuk variabel bacterial uptake, efek mikrobisidal, reaksi DTH dan jumlah bakteri pada hepar dan limpa tidak berbeda bermakna dengan perlakuan kontrol maupun ISCOM. Namun demikian, apabila hasil perlakuan protein whole cell bakteri tersebut dibandingkan dengan protein Adh036, maka dapat diketahui bahwa protein Adh036 mempunyui kemampuan yang lebih tinggi dari pada protein whole cell dalam hal merangsang respons imun seluler yang protektif. Kesimpulan dari semua tahap penelitian adalah protein adhesin Adh036 S.typhi mampu meningkatkan variabel respons imun seluler (kadar IL-12, respiratory burst, bacterial uptake, efek mikrobisidal, kadar lgG2a, jumlah sel TCD8+, dan sel T memori melalui reaksi DTH), sehingga dapat menurunkan kolonisasi bakteri pada usus, dan menghambat invasi bakteri ke dalam hepar dan limpa. Sebagai kesimpulan tambahan adalah bahwa protein Adh036 meningkatkan jumlah fagosit profesional dan IgA sekretori pada usus, serta cenderung meningkatkan jumlah sel NK. Dengan demikian diketahui bahwa protein adhesin Adh036 S.typhi cenderung meningkatkan respons imun non-spesifik dan meningkatkan respons imun spesifik. Kesimpulan tambahan lainnya adalah bahwa protein Adh036 S.typhi: (i) merupakan senyawa glikoprotein yang pada suhu 25°C mempunyai BM 74 kD sedang pada suhu 95°C mempunyai BM 36 kD; (ii) mengaglutinasikan eritrosit manusia golongan darah O, eritrosit mencit dan marmut, tidak mengaglutinasikan eritrosit manusia golongan darah A.B.AB, dan eritrosit domba; (lii) bereaksi spesifik dengan serum penderita demam tifoid; (iv) tersusun dari 2 polipeptida dengan pHi sekitar 4-5, 2 polipeptida dengan pHi antara 5-6 dan 1 polipeptida dengan pHi sekitar 7. Hasil penelitian ini juga menyimpulkan bahwa protein adhesin Adh036 S.typhi menginduksi respons imun seluler protektif yang lebih tinggi dari pada protein whole cell S.typhi. Secara keseluruhan, hasil penelitian ini menunjukkan bahwa protein Adh036 S.typhi layak untuk digunakan sebagai kandidat vaksin demam tifoid

English Abstract

Salmonella typhi (S.typhi) is a negative Gram bacterium which able to live intracellularly in invading tissue outside intestine causing typhoid fever. This time, typhoid fever vaccine which can be found in the market are Ty21A, ViCPS (Vi capsular polysaccharide) and Inactivated Typhoid Vaccine. However, result of evaluation which have been conducted, those vaccines are not yet shown an optimal. Therefore, improvement of typhoid fever vaccine is still needed. The substance of surface bacterium called adhesin is a target of vaccine development that widely studied. At former research have been reported that S.typhi have adhesin protein coming from outer membrane protein with molecular weight around 36 kDa and called AdhG36. Ideally, typhoid fever vaccine is given orally (according to pathomechanism of disease), but most protein antigen do not becoming a good immunogen. To improve immunogenic property protein should be conjugated with adjuvant. ISCOM (immunostimulating complex) is one of inert delivery system that has adjuvant property. ISCOM mentioned as inert delivery system that able to bring the protein into APC to become exogen antigen (MHC-II response) and endogen antigen (MHC-I response). This research is aimed to prove that protein of adhesin Adh036 S.typhi can induce cellular immune response through the variables: IL-12, amount of NK cell, lgG2a, activated macrophage (respiratory burst, bacterial uptake, microbicidal effect), TCO8+ cell, and T-memoiy cell through DTH reaction, so that can prevent bacterium colonization at intestine, spleen and liver. In addition, is also studied about the Adh036 protein character including molecular weight changing by temperature, haemagglutination property, reactivity to patient sera, glycoprotein staining, and isoelectric pH. The result of this research is expected to become the basis of further development of safe vaccine, effective, protective and easy to use. To achieve the target, protein as a subject of this research is conjugated by ISCOM adjuvant. S. typhi bacterium obtained from patient of typhoid fever of R.S.Dr.Saiful Anwar-Malang. Besides of Adh036 protein, the cellular immune response induced ability of the whole cell protein of S.typhi bacterium also be tested. Research conducted in 3 phases, i.e.: protein characterization of adhesin Adh036 and isolation of whole cell (wc) protein. (Phase-1); research to prove the ability of Adh036 protein and whole cell protein in inducing cellular immune response (Phase-2), research to prove ability of whole cell protein and Adh036 in inhibiting systemic invasion by bacterium (Phase-3). At Phase-3, the rate of SlgA intestine was also measured because can be used to explain colonization resistance phenomenon at intestine and systemic organ. Research Phase-1 represent an explorative research. Protein of Adh036 obtained by outer membrane extraction using detergent Chaps, then protein with 36 kD molecular weight separated employing SDS-PAGE. Protein of whole cell obtained by baaerium cell homogenization, then purifed using ammonium sulphate Research of Phase-2 and Phase-3 represent experimental research on mice. Mice was divided into four groups: control, treatment of ISCOM, treatment of Adh036 protein, and treatment of whole cell protein that was conjugated by ISCOM. ISCOMs (antigen-ISCOM) v/as self prepared by mixing Adh036/ whole cell protein with saponin, cholesterol and phosphatidylcholine. On Research Phase-2, immunization of Adh036-ISC0M and whole cell protein-ISCOM was given intramuscularly (i.m.), while immunization on Research Phase-3 was given orally. Protein protectivity test was done using Salmonella typhimurium as an infected bacterium, because the disease symptom and pathomechanism generated on mice similar to typhoid fever caused by Salmonella typhi on human. Result of Research Phase-1 indicate that Adh036 S.typhi adhesin represent glycoprotein compound with molecular weight around 74 kD (at 25°C), and 36 kD molecular weight (at 95°C). The other protein character of Adh036 S.typhi is agglutinates guinea pig erythrocyte, mice, and O human blood group, but not agglutinate sheep erythrocyte and A, B, AB human blood group. This matter generate idea that individual with O blood group susceptible to S.typhi infection, because receptor of erythrocyte and epithelial intestine cell thought are homolog. Response test to typhoid fever patient sera showed that protein of Adh036 react specifically. This result exhibit that the protein has immunogenic character. Moreover, by two dimension electrophoresis known that protein of Adh036 S.typhi consisting five fraction of polypeptide that is two polypeptides have isoelectric pH around 4-5, two polypeptides have isolelectric pH between 3-4 and one polypeptide has isoelectric pH around 7. Result of Research Phase-2 can be elaborated as follows. By using electron microscope, is known that protein of Adh036/whole cell which is conjugated to ISCOM gives particle with dark colour picture in the middle (showing the insertion of protein molecule) surrounded by brighter part which is formed by ISCOM matrix, and diameter size between 40-70 nm. Cellular immune response test obtained that immunizing with protein of Adh036-ISC0M improve IL-12 level higher than control, treatment of ISCOM and of wc-ISCOM (p= 0,0001). Although the test showed the increasing amount of NK cell (average treatment of control = 8, ISCOM = 10,3, Adh036-ISC0M = 159,1, wc-ISCOM = 75,1), but statistically not significantly difference among treatment (p>0,05), that caused by a very big of coefficient variation. This is probably caused by variation of biological experimental animal and can be overcome with enlarging amount of sample. Result of the research also showed that Adh036-ISC0M enhancing significantly the ability of respiratory burst (p=0,001), bacterial uptake (p=0,0001) and microbicidal effect (p=0,014). Referring to ability of bacterial uptake, can be proved that the treatment also improve the amount of macrophage catching bacterium (becoming professional phagocyte) (p=0,0001). Cellular immune response is also known through the enchancement of variable of lgG2a level (ELISA, p=0,0001), TCD8+ cell (immunochemistry, p=0,0001), and T-memory cell through DTH parameter. Result of DTH reaction showed positive reaction (average induration = 2,17 mm) in Adh036-ISC0M treatment, while the other treatment groups show negative reaction. Result of research Phase-3 indicate that protein immunization of Adh036- ISCOM orally increasing S-lgA intestine level (p=0,005), and decreasing colonization significantly of bacterium on intestine, on liver and spleen (p=0,0001 and p=0,016, respectively). The increasing of S-lgA level indicate that protein of Adh036 also induce Th2 response (humoral immune response). By using path analysis, it is known that increasing of IL-12 can cause decreasing of bacterium amount on spleen and liver (total coefficient path = - 1,478),where the influence of activated macrophage (coefficient path = - 1,268) higher than S-lgA intestine (coefficient path = - 0,209). Theoritically, IL-12 is able to activate macrophage by stimulating NK, Th1 cell and TCDS+ cell to produce IFN-y, and then IFN-y will activate macrophage. Treatment on protein of whole cell bacterium compared to control and treatment of ISCOM, indicating that the protein increase the amount of NK cell, and significantly enchancing IL-12 level (p=0,031), respiratory burst (p= 0,016), amount of cell of macrophage becoming professional phagocyte (p= 0,001), amount of cell of TCD8+ (p= 0,0001), rate of lgG2a (p= 0,0001), rate of S-lgA intestine (p= 0,0001), and decrease the amount of bacterium at intestine ( p= 0,008); while for the variable of bacterial uptake, microbicidal effect, DTH reaction and bacterium amount at spleen and liver do not differ with control and ISCOM treatment. But that way, if result of treatment of whole cell protein compared to Adh036 protein, hence were known that protein of Adh036 have the higher ability in the case of protective cellular immune response. The conclusion can be taken from entire research (Phase-1, and Phase-2, and Phase-3) is Adh036 adhesin protein of S.typhi can improve cellular immune response variable, that are: IL-12 level, activated macrophage (respiratory burst, bacterial uptake, microbicidal effect), lgG2a level, amount of TCDS+ cell, and Tmemory cell through DTH parameter, so that can decrease bacterium colonization at intestine, and inhibit bacterium invasion into spleen and liver. Besides, also concluded that Adh036 adhesin protein improve the amount of professional phagocyte, secretory IgA, and tend to improve the amount of NK cell. So, it is known that the adhesin protein Adh036 S.typhi improve both of kinds immune response, innate and adaptive immune response. Other conclusion regarding to character of Adh036 protein S.typhi are: (i) represent as glycoprotein compound of which is on 25°C having 74 kD molecular weight and at 95°C having 36 kD molecular weight; (ii) agglutinates erythrocyte of O human blood group, mouse and guinea pig erythrocyte, but do not agglutinate erythrocyte of A, B, AB human blood group and sheep erythrocyte; {ill) shows specific reaction with serum of typhoid fever patient; (iv) consist of 2 polypeptides with pHi around 4-5, 2 polypeptides with pHi between 5-6 and 1 polypeptide with pHi around 7. Result of this research also conclude that Adh036 protein adhesin of S.typhi induce higher level of protective cellular immune response compared to whole cell protein of S.typhi. As a whole, result of this research indicate that adhesin protein Adh036 of S.typhi competent to be used as typhoid fever vaccine candidate.

Item Type:	Thesis (Doktor)
Identification Number:	-
Divisions:	S2/S3 > Doktor Ilmu Kedokteran, Fakultas Kedokteran
Depositing User:	Sugeng Moelyono
Date Deposited:	18 Jul 2024 07:09
Last Modified:	18 Jul 2024 07:09
URI:	http://repository.ub.ac.id/id/eprint/223908

Text SRI WINARSIH.pdf Download (47MB)

Actions (login required)

View Item