Kusuma, Kavana Hafil and Prof. Dr. Ir. Moch. Sasmito Djati, MS., IPU., ASEAN. Eng and Prof. Widodo, S.Si., M.Sc., Ph.D.Med.Sc (2024) Karakterisasi Virus-Like Praticle (Vlp) Sarscov-2 Pada Sel Hek-293t. Magister thesis, Universitas Brawijaya.
Abstract
Penelitian ini fokus pada virus corona, khususnya SARS-CoV-2 yang menyebabkan COVID-19. Studi mengenai pengembangan pengobatan dan karakterisasi virus ini sangat penting, namun karena keterbatasan fasilitas BSL-3 yang diperlukan untuk penelitian langsung dengan virus asli, metode alternatif seperti Virus-like Particle (VLP) menjanjikan dalam usaha pengembangan obat. Penelitian ini bertujuan untuk membuat konstruksi VLP Konfirmasi isolasi plasmid dilakukan dengan PCR yang menunjukkan pembentukan pita DNA dengan ukuran sesuai target pada plasmid Spike-EGFP, Membran, dan Envelope. Ini menandakan keberhasilan isolasi, yang penting untuk transfeksi pada sel HEK-293T. Penentuan dosis antibiotik dilakukan untuk HEK-293T dengan hasil optimal hygromycin B pada 400 µg/mL dan zeocin pada 200 µg/mL. Dosis ini dipilih berdasarkan toksisitas visual yang diamati selama 7 hari post-treatment. VLP SARS-CoV-2 dihasilkan dari transfeksi plasmid pada sel HEK-293T, ditunjukkan dengan fluoresensi EGFP. Elektroporasi efisien dalam transfeksi ini, memungkinkan observasi VLP melalui mikroskop fluoresen. Morfologi VLP diamati dengan menggunakan pewarnaan negatif pada TEM, menunjukkan trimer spike yang optimal pada envelope SARS-CoV-2. Diameter rata-rata VLP yang dihasilkan adalah 52,94 ± 27,32 nm, lebih kecil dari ukuran virus aslinya karena penggunaan tiga protein struktural (S, M, E) tanpa protein N yang mengemas genom virus. Protein M, E, dan S berperan penting dalam perakitan dan pelepasan VLP, serta mempengaruhi ukuran VLP yang terbentuk.Penelitian ini berhasil dalam menghasilkan Virus-like Particle (VLP) SARS-CoV-2 melalui sel HEK-293T dengan metode elektroporasi dan ko-transfeksi plasmid untuk protein struktural seperti spike, membran, dan envelope. Keberhasilan transfeksi dibuktikan dengan adanya pendaran protein EGFP dan evaluasi morfologi VLP menunjukkan ukuran yang sesuai serta struktur yang benar. Secara keseluruhan, metode ini dapat digunakan untuk memproduksi VLP SARS-CoV-2 yang penting dalam skrining obat-obatan untuk COVID- 19. SARS-CoV-2 pada sel HEK-293T serta mengamati karakteristiknya. Penelitian ini berhasil menghasilkan VLP SARS-CoV-2 menggunakan sel HEK-293T dengan ko-transfeksi plasmid yang mengandung sekuens genetik protein struktural spike, membran, dan envelope virus. Metode elektroporasi digunakan untuk memastikan keberhasilan transfeksi, yang dapat diamati melalui fluoresensi EGFP.
English Abstract
This study focuses on the coronavirus, particularly SARS-CoV-2, which causes COVID-19. Research on the development of treatments and the characterization of this virus is crucial, but due to the limitations of the required BSL-3 facilities for direct research with the original virus, alternative methods such as Virus-like Particles (VLPs) offer a promising avenue for drug development. The aim of this study is to construct SARS-CoV-2 VLPs in HEK-293T cells and observe their characteristics. This research successfully generated SARS-CoV-2 VLPs using HEK-293T cells with co-transfection of plasmids containing the genetic sequences of the spike, membrane, and envelope structural proteins of the virus. The electroporation method was employed to ensure successful transfection, which could be observed through EGFP fluorescence. The confirmation of plasmid isolation was conducted using PCR, which indicated the formation of DNA bands with sizes matching the targets on the Spike-EGFP, Membrane, and Envelope plasmids. This signifies the success of isolation, crucial for transfection into HEK-293T cells. Determination of antibiotic doses was carried out for HEK-293T, yielding optimal results with hygromycin B at 400 µg/mL and zeocin at 200 µg/mL. These doses were selected based on visual toxicity observed over a 7-day post-treatment period. Viruslike particles (VLPs) of SARS-CoV-2 were generated from plasmid transfection into HEK- 293T cells, as evidenced by EGFP fluorescence. Efficient electroporation in this transfection enabled VLP observation through fluorescent microscopy. VLP morphology was examined using negative staining in TEM, revealing optimal spike trimers on the SARS-CoV-2 envelope. The average diameter of produced VLPs was 52.94 ± 27.32 nm, smaller than the original virus size due to the use of three structural proteins (S, M, E) without the genomic packaging protein N. Proteins M, E, and S played crucial roles in VLP assembly and release, influencing the resulting VLP size.iv This study successfully produced Virus-like Particles (VLPs) of SARS-CoV-2 using HEK-293T cells through electroporation and co-transfection of plasmids encoding structural proteins such as spike, membrane, and envelope. Transfection success was confirmed by EGFP protein fluorescence, and VLP morphology evaluation indicated appropriate size and correct structure. Overall, this method can be utilized for producing VLPs of SARS-CoV-2, crucial for drug screening against COVID-19.
| Item Type: | Thesis (Magister) |
|---|---|
| Identification Number: | 0424090019 |
| Divisions: | S2/S3 > Magister Biologi, Fakultas MIPA |
| Depositing User: | Unnamed user with username nova |
| Date Deposited: | 23 Jul 2024 07:41 |
| Last Modified: | 23 Jul 2024 07:41 |
| URI: | http://repository.ub.ac.id/id/eprint/221615 |
![[thumbnail of DALAM MASA EMBARGO]](http://repository.ub.ac.id/style/images/fileicons/text.png) |
Text (DALAM MASA EMBARGO)
KAVANA HAFIL KUSUMA.pdf Restricted to Registered users only Download (9MB) |
Actions (login required)
 |
View Item |