Seputra, Maulana Wildan and Dr.rar.nat Tri Yudani Mardining Raras, M.App.,Sc and DR. dr. Hani Susianti, Sp.PK(K) (2022) Pemanfaatan Gen YidR Klebsiella pneumoniae Untuk Desain Vaksin Multiepitop Menggunakan Pendekatan In Silico. Magister thesis, Universitas Brawijaya.
Abstract
K. pneumoniae merupakan bakteri gram negatif yang bersifat patogen oportunistik dalam proses infeksi. Bakteri ini merupakan salah satu penyebab terjadinya Hospital Acquired Infection terbanyak ketiga di United States. Selain itu, K. pneumoniae juga dapat menyebabkan infeksi serius seperti infeksi saluran kemih dan infeksi pembuluh darah. Seiring dengan meningkatnya mutasi, muncul tipe hipervirulen yang memiliki karakteristik dapat menginfeksi individu sehat dibandingkan dengan tipe klasik yang hanya menginfeksi pasien dengan kondisi immunocompromised. Hal ini diperparah dengan terjadinya peningkatan resistansi terhadap antibiotik sehingga perlu dilakukan langkah preventif yang efektif. Subunit vaksin merupakan vaksin yang diproduksi dengan memanfaatkan bagian kecil dari patogen yang dapat memicu reaksi imun penting dalam tubuh hingga memunculkan kekebalan. Pengembangan vaksin melawan Klebsiella telah dilakukan, tetapi sampai sekarang belum ada yang dikomersialkan karena berbagai alasan salah satunya karena heterogenitas dari strainnya. Sejauh ini, vaksin untuk Klebsiella telah dikembangkan dengan memanfaatkan siderophore receptor protein yang ditujukan untuk mastitis yang menginfeksi binatang ternak yang sedang menyusui. Berdasarkan analisis profil genomik dan virulensi dari 308 strain K. pneumoniae didapatkan satu gen yang ditemukan pada semua isolat yaitu gen YidR. Terlebih gen ini ditemukan cukup mirip pada isolat yang berbeda dengan homologi mencapai 97.6%. Secara fungsi, gen YidR diduga mengkode ATP/GTP-binding protein yang berperan dalam mediasi hyperadherence phenotype. Prevalensi dan kesamaan sekuens dari gen YidR membuat gen ini menjadi target yang memiliki potensi untuk pembentukan antigen terhadap K. pneumoniae. TLR (Toll-like Receptor) merupakan kelompok protein transmembran yang berperan dalam identifikasi PAMP (Pathogen Associated Molecular Pattern) dari patogen yang masuk dalam tubuh. TLR terdiri dari berbagai macam tipe, namun Infeksi K. pneumonia akan memicu peningkatan ekspresi dari TLR2 dan TLR4 di saluran napas. Kedua TLR ini akan memanfaatkan jalur pensinyalan protein MyD88 yang memiliki fungsi memicu rangkaian respon imun dari tubuh. Protein- protein ini merupakan protein target yang dapat dimanfaatkan untuk mengetahui respon tubuh terhadap vaksin untuk K. pneumoniae yang diberikan. Pendekatan in silico memanfaatkan metode komputasi untuk dapat memprediksi dan mendesain konstruksi vaksin baru. Secara umum, pendekatan ini dibagi menjadi dua cabang keilmuan yaitu bioinformatika dan imunoinformatika yang keduanya berperan untuk memberikan data biologis dan mengetahui interaksi berbagai molekul dalam sistem imun menggunakan simulasi menggunakan algoritma tertentu. Kemajuan bidang in silico dapat membantu proses pengembangan vaksin dengan desain yang rasional, namun tetap efektif dalam waktu dan biaya. Dalam penelitian ini, sekuens gen YidR yang didapatkan dari penelitian sebelumnya diidentifikasi lebih lanjut menggunakan database dari NCBI (blastx) untuk mendapatkan format FASTA untuk kemudahan langkah selanjutnya.Sekuens gen yang dipilih berdasarkan Query cover dan Percentile Rank yang paling mendekati 100%. Setelah itu gen YidR akan dianalisa terkait dengan prediksi epitop untuk sel B dan sel T menggunakan program dari IEDB dengan rincian Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0 untuk sel B, NetMHCpan EL 4.1 untuk sel T sitotoksik dengan kriteria inklusi epitop yang dipilih memiliki percentile rank berada dibawah <1% dan metode konsensus untuk sel T helper dengan kriteria inklusi epitop yang dipilih memiliki adjusted rank berada dibawah <2% sebagai strong binder. Epitop yang didapatkan dianalisis lebih lanjut yang terdiri dari uji antigenisitas menggunakan VaxiJen, uji alergenitas digunakan AllerTOP dan uji toksisitas melalui ToxinPred. Analisis antigenisitas, alergenitas, dan toksisitas diperlukan untuk memastikan konstruksi vaksin yang dihasilkan dapat memberikan efek imunitas yang diinginkan tanpa memicu reaksi yang tidak perlu. Setiap epitop kemudian dihubungkan dengan adjuvant berupa Cholera Toxin B (CTB) dan linker yang spesifik untuk tiap jenis sel: EAAAK untuk menghubungkan adjuvant dengan sekuens lain, AAY untuk epitop dari sel T sitotoksik, dan GPGPG untuk epitop dari sel T helper dan sel B. Linker memiliki fungsi memastikan setiap epitop terpisah sehingga tidak mengubah sifat epitop sekaligus memberikan konformasi protein yang stabil Hasil konstruksi desain vaksin kemudian dimodelkan secara tiga dimensi menggunakan program trRosetta dan dievaluasi menggunakan plot Ramachandran. Hasil permodelan menggunakan trRosetta menunjukkan TM-score sebesar 0.576 dan Ramachandran Favored sebesar 94.42% menunjukkan model yang dihasilkan memiliki tingkat kepercayaan yang tinggi. Sebagai kandidat vaksin, protein YidR perlu dilakukan uji sifat fisiokemikal vaksin menggunakan ExPASy Protparam. Konstruksi vaksin yang didapatkan menunjukkan desain yang dianggap stabil, bersifat hidrofilik, dengan titik isoelektrik teoritis berada pada nilai 8.54 serta memiliki perkiraan waktu paruh sebesar 30 jam pada sel retikulosit mamalia secara in vitro. Kemudian, dilakukan uji molecular docking menggunakan program HDOCK dengan protein target TLR2 dan TLR4 sehingga dapat memprediksi probabilitas konstruksi vaksin terhadap proses induksi respon imun dalam tubuh. Binding affinity score yang didapatkan adalah -244.72 untuk TLR2 dan -266.51 untuk TLR4, mengindikasikan bahwa ikatan yang terjadi cukup stabil.
English Abstract
K. pneumoniae is a gram-negative bacteria that is an opportunistic pathogen in the process of infection. This bacterium is one of the causes of the third largest Hospital Acquired Infection in the United States. In addition, K. pneumoniae can also cause serious infections such as urinary tract infections and blood vessel infections. As mutations increase, a hypervirulent type emerges, which is characterized by the ability to infect healthy individuals as compared to the classical type, which only infects immunocompromised patients. This is exacerbated by the increase in resistance to antibiotics, so it is necessary to take effective preventive measures. Vaccine subunits are vaccines produced by utilizing small parts of a pathogen that can trigger important immune reactions in the body to induce immunity. The development of a vaccine against Klebsiella has been carried out, but so far none has been commercialized for various reasons, one of which is the heterogeneity of the strains. So far, a vaccine for Klebsiella has been developed utilizing a siderophore receptor protein aimed at mastitis infecting lactating farm animals. Based on the analysis of the genomic and virulence profiles of 308 strains of K. pneumoniae, one gene was found in all isolates, namely the YidR gene. Moreover, this gene was found to be quite similar in different isolates with homology reaching 97.6%. Functionally, the YidR gene is thought to encode an ATP/GTP-binding protein that plays a role in mediating the hyperadherence phenotype. The prevalence and similarity of the YidR gene sequences make this gene a potential target for antigen formation against K. pneumoniae. TLR (Toll-like Receptor) is a group of transmembrane proteins that play a role in the identification of PAMP (Pathogen Associated Molecular Pattern) from pathogens that enter the body. TLR consists of various types, but infection with K. pneumonia will trigger an increase in the expression of TLR2 and TLR4 in the respiratory tract. These two TLRs will utilize the MyD88 protein signaling pathway which has the function of triggering a series of immune responses from the body. These proteins are target proteins that can be used to determine the body's response to the given vaccine for K. pneumoniae. The in silico approach utilizes computational methods to predict and design new vaccine constructions. In general, this approach is divided into two scientific branches, namely bioinformatics and immunoinformatics, both of which play a role in providing biological data and knowing the interactions of various molecules in the immune system using simulations using certain algorithms. Advances in the field of in silico can help the vaccine development process with a rational design, but still effective in time and cost. In this study, the YidR gene sequences obtained from previous studies were further identified using the NCBI database (blastx) to obtain the FASTA format for the convenience of the next step. Gene sequences are selected based on Query cover and Percentile Rank which is closest to 100%. After that the YidR gene will be analyzed related to epitope prediction for B cells and T cells using the IEDB program with details of Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0 for B cells, NetMHCpan EL 4.1 for cytotoxic T cells with the selected epitope inclusion criteria having a percentile rank below < 1% and the consensus method for helper T cells with selected epitope inclusion criteria has an adjusted rank below <2% as a strong binder. The epitope obtained was further analyzed consisting of an antigenicity test using VaxiJen, an allergenicity test using AllerTOP and a toxicity test using ToxinPred. Analysis of antigenicity, allergenicity, and toxicity is needed to ensure that the resulting vaccine construction can provide the desired immune effect without triggering unnecessary reactions. Each epitope was then linked to an adjuvant in the form of Cholera Toxin B (CTB) and a linker specific for each cell type: EAAAK to link the adjuvant to other sequences, AAY to epitope from cytotoxic T cells, and GPGPG to epitope from helper T cells and B cells. The linker has the function of ensuring that each epitope is separated so that it does not change the nature of the epitope while providing a stable protein conformation The results of the vaccine design construction were then modeled in three dimensions using the trRosetta program and evaluated using the Ramachandran plot. The results of modeling using trRosetta showed a TM-score of 0.576 and Ramachandran Favored of 94.42% indicating that the resulting model has a high level of confidence. As a vaccine candidate, the YidR protein needs to be tested for the physiochemical properties of the vaccine using ExPASy Protparam. The vaccine construction obtained shows a design that is considered stable, hydrophilic, with a theoretical isoelectric point of 8.54 and an estimated half-life of 30 hours in mammalian reticulocyte cells in vitro. Then, a molecular docking test was carried out using the HDOCK program with the target proteins TLR2 and TLR4 so as to predict the probability of vaccine construction on the process of induction of immune responses in the body. The binding affinity score obtained was -244.72 for TLR2 and -266.51 for TLR4, indicating that the binding was quite stable.
| Item Type: | Thesis (Magister) |
|---|---|
| Identification Number: | 042206 |
| Divisions: | S2/S3 > Magister Ilmu Biomedis, Fakultas Kedokteran |
| Depositing User: | soegeng sugeng |
| Date Deposited: | 02 May 2024 02:37 |
| Last Modified: | 02 May 2024 02:37 |
| URI: | http://repository.ub.ac.id/id/eprint/218775 |
![[thumbnail of DALAM MASA EMBARGO]](http://repository.ub.ac.id/style/images/fileicons/text.png) |
Text (DALAM MASA EMBARGO)
Maulana Wildan Seputra.pdf Restricted to Registered users only Download (4MB) |
Actions (login required)
 |
View Item |