Pengembangan Marka SCAR Berbasis Sekuen ISSR tanpa dan dengan Teknik Kloning untuk Deteksi Kandungan Senyawa Capsaicin pada Cabai (Capsicum spp.).

S. Miftachul, Jannah and Dr. Ir. Joni Kusnadi,, M.Si and Prof. Dr. Ir. Estri Laras Arumingtyas,, M.Sc. St. (2023) Pengembangan Marka SCAR Berbasis Sekuen ISSR tanpa dan dengan Teknik Kloning untuk Deteksi Kandungan Senyawa Capsaicin pada Cabai (Capsicum spp.). Sarjana thesis, Universitas Brawijaya.

Abstract

Secara umum tahap seleksi menggunakan teknik konvensional memerlukan waktu yang lama dan kurang akurat. Oleh karena itu penggunaan marka molekuler diera perkembangan ilmu bioteknologi diyakini mampu menjadi suatu metode seleksi yang lebih akurat, cepat serta tidak dipengaruhi lingkungan. Tujuan penelitian ini yaitu melakukan pengembangan serta menganalisis keefektivan marka SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions) berbasis sekuen ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) dengan dan tanpa teknik kloning untuk mendeteksi tingkat kepedasan pada cabai. Keunggulan marka ISSR secara teknis yaitu analisisnya cepat, murah, jumlah DNA yang digunakan sedikit serta mampu mendeteksi genetic polimorfism tanpa perlu mengetahui susunan basa genom yang dianalisis. Namun, marka ISSR memiliki kekurangan yaitu bersifat dominan, sehingga ISSR perlu dikembangkan agar dapat menghasilkan marka kodominan seperti marka SCAR. Pada penelitian sebelumnya telah dilakukan pengembangan dan desain marka SCAR berdasarkan sekuen ISSR. Namun, hasil desain marka SCAR berdasarkan sekuen ISSR belum dapat digunakan untuk mendeteksi tingkat kepedasan pada cabai. Oleh karena itu pada penelitian ini akan dilakukan perbandingan pengembangan marka SCAR berbasis sekuen ISSR dengan dan tanpa teknik kloning. Tujuan menggunakan teknik kloning agar dapat menghasilkan salinan fragmen yang lebih banyak sehingga hasil amplifikasi menjadi lebih jelas dan polimorfik. Tahapan pengembangan SCAR diawali dengan mengisolasi DNA daun cabai rawit dengan metode CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide) dengan modifikasi penambahan PVP 2% serta βMercapthoetanol. Kemudian, dilakukan analisis kemurnian serta konsentrasi DNA menggunakan nandrop spektrofotometer. Selanjutnya, amplifikasi ISSR serta elektroforesis untuk mengetahui hasil amplifikasi fragmen primer ISSR diperoleh pita polimorfik (gen target), dilakukan sekuensing untuk perlakuan tanpa teknik kloning sedangkan dengan teknik kloning akan dilanjutkan pada tahap kloning yaitu purifikasi gel pita gen target untuk memperoleh DNA yang murni, ligasi, transformasi untuk mendapatkan sekuen DNA gen target dan memperbanyaknya. Kemudian dilakukan konfirmasi ulang hasil kloning melalui PCR, sekuensing untuk mengetahui urutan basa nukleotida dari fragmen DNA yang diinginkan, Hasil sekuensing digunakan untuk dasar desain marka SCAR berbasis sekuen ISSR. Efektivfitas marka yang di desain di amplifikasi menggunakan PCR untuk validasi pengujian kualitas primer SCAR dari hasil sekuensing yang telah dikloning. Kemudian dilakukan perbandingan keefektivan dengan dan teknik tanpa kloning dalam pengembangan marka SCAR tersebut. Berdasarkan hasil yang diperoleh dari pengembangan marka SCAR lebih efektiv tanpa menggunakan teknik kloning. Hal tersebut dikarenakan primer SCAR yang dihasilkan dengan teknik kloning ketika di konfirmasi pada sampel cabai dengan tingkat kepedasan yang berbeda menghasilkan pita monomorfik sedangkan tanpa teknik kloning mampu menghasilkan pita polimorfik. Berdasarkan data berikut Primer 3_M14_NK menghasilkan pita monomorfik, primer 3_PR_NK mampu menghasilkan pita polimorfik dengan sampel M8 pada ukuran 400 bp, serta sampel PR ukuran 800 bp, primer 3_CR_NK juga mampu menghasilkan pita polimorfik namun sangat riskan dikarenakan pita yang diperoleh sangat tipis yaitu pada sampel M14 ukuran 200 bp serta sampel CR ukuran 500 bp serta primer 3_CR_K yang menghasilkan pita monomorfik. Sehingga dari hasil tersebut membutuhkan peninjauan (konfirmasi) lanjutan baik mengenai kurangnya variasi desain primer SCAR 5’ dan 3’ anchord pada situs penempelan primer serta penentuan suhu annealing yang tepat.

English Abstract

In general, the selection stage using conventional techniques requires a long time and is less accurate. Therefore the use of molecular markers in the era of the development of biotechnology is believed to be able to become a selection method that is more accurate, fast, and not influenced by the environment. The purpose of this study was to develop and analyze the effectiveness of SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions) markers based on ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) sequences with and without cloning techniques to detect the level of spiciness in chilies. The technical advantages of ISSR markers are that the analysis is fast, inexpensive, the amount of DNA used is small and it is able to detect genetic polymorphisms without the need to know the base composition of the genome being analyzed. However, ISSR markers have the disadvantage of being dominant, so ISSR needs to be developed in order to produce codominant markers such as SCAR markers. In previous studies, the development and design of SCAR markers based on ISSR sequences had been carried out. However, the results of the SCAR marker design based on the ISSR sequence cannot be used to detect the level of spiciness in chilies. Therefore, in this study, a comparison of the development of SCAR markers based on ISSR sequences with and without cloning techniques will be carried out. The cloning technique aims to produce more copies of the fragments so that the amplification results become more apparent and more polymorphic. The stages of SCAR development began with isolating DNA from cayenne pepper leaves using the CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide) method with the addition of 2% PVP and β-Mercapthoetanol modification. Then, analysis of the purity and concentration of DNA was carried out using a nanodrop spectrophotometer. Furthermore, ISSR amplification and electrophoresis to determine the results of ISSR primer fragment amplification obtained polymorphic bands (target genes). , transformation to get the DNA sequence of the target gene and reproduce it. Then reconfirm the cloning results via PCR, and sequencing to determine the nucleotide base sequence of the desired DNA fragment. The sequencing results are used to design the basis for SCAR markers based on ISSR sequences. The effectiveness of the designed markers was amplified using PCR to validate the SCAR primary quality test from the cloned sequencing results. Then a comparison of the effectiveness with and without cloning techniques was carried out in developing these SCAR markers. Based on the results obtained from the development of more effective SCAR markers without using cloning techniques. This is because the SCAR primers produced by the cloning technique when confirmed in chili samples with different levels of spiciness produce monomorphic bands whereas without the cloning technique, they are able to produce polymorphic bands. Based on the following data, primer 3_M14_NK produces monomorphic bands, primer 3_PR_NK is capable of producing polymorphic bands with M8 samples at 500 bp size, as well as PR samples at 900 bp size, primer 3_CR_NK is also capable of producing polymorphic bands but it is very risky because the bands obtained are very thin, namely on M14 samples of 200 bp size as well as a 500 bp CR sample, and 3_CR_K primer which produces a monomorphic band. So that these results require further review (confirmation) both regarding the lack of variations in the design of the SCAR 5' and 3' anchor anchors at the primary attachment site and determining the appropriate annealing temperature.

Item Type:	Thesis (Sarjana)
Identification Number:	052310
Uncontrolled Keywords:	Cabai (Capsicum spp.), kandungan Capsaicin, SCAR (Sequence Characterized Amplified Region), ISSR (Inter Simple Sequence Repeat). Chili (Capsicum spp.), Capsaicin content, SCAR (Sequence Characterized Amplified Region), ISSR (Inter Simple Sequence Repeat).
Divisions:	Fakultas Teknologi Pertanian > Keteknikan Pertanian
Depositing User:	Unnamed user with username verry
Date Deposited:	18 Jan 2024 04:06
Last Modified:	18 Jan 2024 04:06
URI:	http://repository.ub.ac.id/id/eprint/211961

Text (Dalam Masa Embargo) S. Miftachul Jannah.pdf Restricted to Registered users only until 31 December 2025. Download (9MB)

Actions (login required)

View Item