Optimasi Suhu dan Waktu Inkubasi dalam Proses Isolasi DNA Metode direct-PCR untuk Deteksi Kandungan DNA Tikus (Rattus norvegicus) Menggunakan Primer Spesifik 12S rRNA Metode Real-time PCR

Iftia, Meliyana and Dr. Ir. Joni Kusnadi,, M.Si (2022) Optimasi Suhu dan Waktu Inkubasi dalam Proses Isolasi DNA Metode direct-PCR untuk Deteksi Kandungan DNA Tikus (Rattus norvegicus) Menggunakan Primer Spesifik 12S rRNA Metode Real-time PCR. Sarjana thesis, Universitas Brawijaya.

Abstract

Meningkatnya kesadaran masyarakat terhadap makanan halal menyebabkan semakin tingginya tuntutan terhadap makanan yang bersertifikat halal. Berdasarkan aspek agama dan kesehatan, identifikasi jenis daging untuk keaslian makanan berbahan dasar daging sangat penting tidak hanya bagi konsumen tetapi juga bagi regulator dan produsen. Pemalsuan daging sapi dengan daging tikus kerap dilakukan oleh produsen bertujuan untuk menekan biaya produksi dan menjual dengan harga yang lebih terjangkau untuk mendapatkan keuntungan ekonomi yang lebih. Telah dilakukan metode deteksi cepat spesies daging dengan teknik direct-PCR dan amplifikasi menggunakan PCR konvensional. Namun, PCR konvensional membutuhkan tahap yang panjang dan memakan banyak waktu. Dengan demikian, pada penelitian ini akan dilakukan metode deteksi cepat spesies daging tikus dengan teknik isolasi DNA direct-PCR dan amplifikasi menggunakan Real-time PCR. Mesin Real-time PCR dinilai lebih cepat jika dibandingkan dengan PCR konvensional. Sampel daging tikus yang digunakan berasal dari tikus spesies Rattus norvegicus karena spesies ini merupakan golongan tikus domestik yang populasinya banyak berada di area pemukiman manusia, sehingga dianggap sebagai hama dan kerap ditangkap. Metode isolasi DNA yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode direct-PCR, yaitu metode isolasi DNA tanpa proses pemurnian DNA yang panjang sehingga tidak memakan banyak waktu. Dilakukan optimasi suhu dan waktu inkubasi pada proses isolasi DNA dari daging tikus untuk menentukan suhu dan waktu optimum inkubasi dalam mendapatkan DNA dengan jumlah yang paling banyak sehingga pada amplifikasi dapat memunculkan nilai Ct yang rendah. Dilakukan uji validasi yang meliputi uji spesifisitas dan uji Limit of Detection (LoD). Uji spesifisitas untuk mengetahui kesesuaian primer 12S rRNA yang digunakan terhadap spesies tikus. Sedangkan uji LoD untuk mengetahui batas konsentrasi DNA terendah yang dapat dideteksi oleh metode yang digunakan. Hasil dari peneltian ini didapatkan suhu dan waktu inkubasi paling optimal adalah suhu 85°C dan waktu 25 menit karena menghasilkan nilai konsentrasi DNA paling tinggi dibandingkan dengan variasi suhu dan waktu lainnya, yaitu sebesar 459,56 ng/μL. Hasil amplifikasinya juga memunculkan nilai Ct yang paling konstan pada tiga kali ulangan yaitu 23,28; 26,38; dan 20,29. Primer 12S rRNA yang digunakan spesifik terhadap spesies daging tikus, ditunjukkan dengan munculnya nilai Ct sebesar 19,375 pada sampel daging tikus sedangkan pada sampel spesies lain tidak memunculkan nilai Ct. Metode yang digunakan memiliki sensitivitas mendeteksi DNA tikus hingga konsentrasi 5 × 10-4 ng/μL sebagai nilai LoD pada penelitian ini.

English Abstract

The increasing public awareness of halal food has led to higher demands for halal-certified food. Based on the religious and health aspects, authentication of meat-based foods is very important to consumer, regulator and producers. Beef forgery using rat meat is often done with aim to reduce production costs and increase economic benefits. Direct-PCR has been used for rapid detection and is acknowledged as more efficient than conventional PCR. However, conventional PCR is a long and time-consuming step. Thus, in this study, a rapid detection method of rat meat species will be carried out using direct-PCR DNA isolation techniques and amplification using Real-time PCR. Real-time PCR machines are considered to be faster when compared to conventional PCR. The rat meat samples used came from Rattus norvegicus species because this species is a class of domestic rats whose populations are mostly in human settlement areas, so they are considered pests and are often caught. The DNA isolation method used in this study is the direct-PCR method, which is a DNA isolation method without a long DNA purification process so it does not take much time. Optimizing the temperature and incubation time in the DNA isolation process from rat meat to determine the optimum temperature and incubation time to obtain the highest amount of DNA so that the amplification can produce a low Ct value. Validation tests were carried out which included specificity tests and Limit of Detection (LoD) tests. Specificity test was done to determine the suitability of the 12S rRNA primer used against mouse species. LoD test was done to determine the lowest limit of DNA concentration that can be detected by the method used. The results of this research, it was found that the most optimal temperature was 85°C with incubation time of 25 minutes, which produced the highest DNA concentration value of 459,56 ng/μL. The amplification results also showed the most constant Ct value in three replications, namely 23,28; 26,38; and 20,29. The 12S rRNA primer used was specific for the rat meat species, indicated by the appearance of a Ct value of 19,375 in the rat meat sample, while in the sample of other species there was no Ct value. The method used has a sensitivity to detect mouse DNA up to a concentration of 5 × 10-4 ng/μL as the LoD value in this study.

Item Type:	Thesis (Sarjana)
Identification Number:	0522100249
Uncontrolled Keywords:	12S rRNA, direct-PCR, DNA Tikus, Isolasi DNA, Real-time PCR,12S rRNA, direct-PCR, DNA Isolation, Rat DNA, Real-time PCR
Subjects:	600 Technology (Applied sciences) > 630 Agriculture and related technologies
Divisions:	Fakultas Teknologi Pertanian > Keteknikan Pertanian
Depositing User:	soegeng sugeng
Date Deposited:	07 Nov 2022 02:26
Last Modified:	07 Nov 2022 02:26
URI:	http://repository.ub.ac.id/id/eprint/196160

Text (DALAM MASA EMBARGO) Meliyana Iftia.pdf Restricted to Registered users only until 31 December 2024. Download (2MB)

Actions (login required)

View Item