Efek Pemberian Escalating Dose Immunotherapy (EDI) Menggunakan Self Antigen dsDNA terhadap Jumlah Sel T Helper 2 (Th2) dan Kadar Interleukin-4 (IL-4) pada Mencit Pristane Induced Lupus (PIL)

Hartanti, Khoirunisah Dwi and Prof. Dr. dr.Kusworini Handono,, M.Kes., SpPK and Dr. dr. Nurdiana,, M.Kes (2018) Efek Pemberian Escalating Dose Immunotherapy (EDI) Menggunakan Self Antigen dsDNA terhadap Jumlah Sel T Helper 2 (Th2) dan Kadar Interleukin-4 (IL-4) pada Mencit Pristane Induced Lupus (PIL). Magister thesis, Universitas Brawijaya.

Abstract

Lupus Eritematosus Sistemik (LES) adalah suatu penyakit autoimun sistemik yang bersifat kronis dan melibatkan kerusakan multi organ. Pada LES terjadi aktivasi yang berlebihan dari sel T dan sel B menyebabkan aktivitas LES meningkat. Escalating Dose (Antigen-Spesifik) Immunotherapy / EDI adalah metode terapi untuk mensupresi respon imun melaui mekanisme toleransi dengan cara menginjeksikan autoantigen (self-antigen dengan dosis yang bertahap. Metode EDI telah diteliti pada penyakit autoimun multiple sclerosis dan terbukti mampu mengembalikan toleransi imun dengan menginduksi aktivasi dan fungsi pada Treg untuk sekresi sitokin IL-10 dan TGF-β yang bekerja menekan sel imun autoreaktif termasuk sel T dan sel B. Peningkatan proliferasi sel Th2 akibat pengenalan self antigen oleh APC berkontribusi pada hiperaktivitas sel B autoreaktif yang berperan penting pada produksi autoantibodi pada LES. IL-4 sebagai salah satu sitokin yang diproduksi oleh sel Th2 berperan dalam meningkatkan diferensiasi sel B dan juga sel T, terutama sel T-helper 2 (Th2). Beberapa penelitian menunjukkan kadar IFNγ yang meningkat pada serum darah pasien LES dan ketidakseimbangan sitokin Th1 (IFNγ) dan Th2 (IL-4) berhubungan dengan peningkatan aktivitas penyakit lupus pada mencit model lupus. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui efek pemberian terapi EDI menggunakan self-antigen dsDNA dalam berbagai dosis pada mencit Balb/c pristane induced lupus (PIL) terhadap persentase sel Th2, kadar IL-4, serta rasio kadar IFNγ/IL-4. Metode penelitian yang dilakukan adalah desain eksperimen murni di laboratorium secara in vivo. Mencit betina Balb/c berusia 6-8 minggu dibagi kelompok kontrol negatif (mencit normal, n=5) dan kelompok mencit pristane induced lupus (PIL). Kelompok mencit PIL diberi injeksi 0,5 cc (782μg/ml) pristane secara i.p. Dua belas minggu paska injeksi pristane, mencit dievaluasi manifestasi klinis dan serologis (kadar anti-dsDNA). Mencit yang menunjukkan tanda-tanda lupus atau mencit PIL dibagi menjadi empat kelompok diantaranya kelompok kontrol positif (n=5): mencit PIL tanpa terapi EDI dsDNA, kelompok terapi A (n=5): mencit PIL dengan terapi EDI dsDNA dosis I (0.01 μg/ml, 0.1 μg/ml, 1 μg/ml), kelompok terapi B (n=5): mencit PIL dengan terapi EDI dsDNA dosis II (0.1 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml), dan kelompok terapi C (n=5): mencit PIL dengan terapi EDI dsDNA dosis III (1 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml) diberikan satu kali setiap minggu secara berurutan. Persentase sel Th2 diukur menggunakan metode flowcytometry dari limpa sedangkan kadar IL-4 dan IFN-γ diukur menggunakan metode ELISA dari serum darah mencit. Analisis data dilakukan dengan tingkat kepercayaan 95%. Uji beda dilakukan dengan uji One Way ANOVA jika data terdistribusi normal dan homogen dan uji Kruskal Wallis jika data tidak terdistribusi normal dan atau tidak homogen. Uji post hoc dilakukan untuk mengetahui perbedaan antar kelompok. Hasil penelitian ini menunjukkan pemberian injeksi pristane secara IP dosis tunggal dapat menginduksi tanda-tanda lupus yaitu penurunan berat badan, bulu rontok, penurunan aktivitas dan peningkatan kadar anti-dsDNA secara signifikan. Hasil menunjukkan rata-rata persentase sel Th2 pada kelompok terapi A (3,28 ± 0,64), B (3,31 % ± 1,12), dan C (3,44 % ± 0,52) cenderung mengalami penurunan dibanding kelompok K(+)(4,31 % ± 0,39) meskipun tidak signifikan. Kadar IL4 pada kelompok terapi A (3,17 ± 0,42; p=0.037), B (4,22 ± 3,61; p=0.024), dan C (5,02 ± 3,42; p=0.005) cenderung meningkat dibandingkan kelompok positif (1,60 ± 0,51) secara signifikan (p<0,05). Rasio IFNγ/IL-4 pada kelompok terapi A (3601.11 ± 1070.77; p=0.003), B (2934.61 ± 1083.00; p=0.001) dan C (2953.56 ± 1584.28; p=0.001) mengalami penurunan signifikan jika dibandingkan kelompok K(+)( 7814.15 ± 2331.95) yang menunjukkan pemberian terapi EDI dsDNA dapat menurunkan rasio IFNγ/IL-4.Pada penelitian ini pemberian EDI dsDNA pada kelompok mencit PIL dapat menurunkan jumlah sel Th2 melalui peningkatan sel T-Reg dan produksi sitokin imunomodulator IL-10 dan TGF-β. Pada penelitian sebelumnya, pemberian imunoterapi dengan antigen spesifik dengan metode EDI terbukti dapat menginduksi aktivasi dan fungsi pada Treg untuk sekresi sitokin IL-10 dan TGF-β yang bekerja menekan sel imun autoreaktif. Sel Treg memiliki peran penting dalam pengembangan terapi toleransi dengan antigen spesifik dan induksi sitokin IL10 sebagai imunomodulator. Peningkatan kadar IL-4 pada mencit PIL akibat pemberian EDI dsDNA diduga tidak hanya karena adanya produksi IL-4 oleh sel Th2 tetapi juga produksi dari sel-sel lain seperti sel mast, sel basofil, dan sel B. Peningkatan kadar IL-4 ini sebagai regulator untuk menekan aktivitas sel Th1 yang berlebih. Aktivitas Th1 salah satunya ditandai dengan produksi IFN-γ. Th2 juga memproduksi sitokin IL-4 yang bersifat antagonis terhadap IFN-γ dan menekan aktivasi makrofag. Aktivitas Th2 kemungkinan berfungsi sebagai regulator fisiologis pada respon imun dengan menghambat efek yang mungkin membahayakan dari respon Th1. Menurunnya rasio IFNγ/IL-4 pada mencit PIL yang diberikan terapi EDI dsDNA menjelaskan hasil pengukuran kadar IL-4 yang meningkat pada penelitian ini. Peningkatan kadar IL-4 pada kelompok mencit yang diberi terapi EDI dsDNA diduga sebagai kompensasi untuk menekan produksi sitokin IFN-γ lupus. Mengembalikan keseimbangan produksi IFN-γ dan IL-4 diharapkan dapat menjadi target terapi untuk menghambat kerusakan organ pada LES dan pada penelitian ini, pemberian terapi EDI dsDNA pada mencit PIL berhasil mengembalikan keseimbangan IFN-γ/IL-4 mendekati mencit normal. Pemberian EDI dsDNA tidak dapat menurunkan kadar IL-4 pada mencit PIL. Efek pemberian EDI dsDNA pada mencit PIL menunjukkan penurunan jumlah sel Th2 dan penurunan rasio IFNγ/IL-4 dengan dosis terbaik didapatkan pada kelompok dosis II (0.1 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml).

English Abstract

Systemic Lupus Erythematosus (SLE) is chronic autoimmune diseases which involve multi-organ damage. Previous studies found that in LES patient, excessive activation of T cells caused LES exacerbation. Escalating Dose (Antigen-Specific) Immunotherapy / EDI is a therapeutic method for suppressing the immune response through the tolerance mechanism by injecting autoantigen (self-antigen). This method has been studied in autoimmune multiple sclerosis with Myelin Basic Protein injection and has been shown to be able to restore immune tolerance by inducing activation and function of T-reg cells to increased level of IL-10 and TGF-β cytokine that can regulate autoreactive cells including autoreactive T cells and B cells. The increased proliferation of Th2 cells due to the introduction of self-antigen by APC contributes to the autoreactive B cell hyperactivity that plays an important role in the production of autoantibodies in LES. IL-4 as one of the cytokines produced by Th2 cells plays a role in increasing the differentiation of B cells as well as T cells, especially T-helper 2 (Th2) cells. Several studies have shown that elevated IFN-γ levels in blood serum of LES patients and imbalance of Th1 (IFN-γ) and Th2 (IL-4) cytokines are associated with increased lupus disease activity in lupus model mice. This study was aim to determine the effect of EDI therapy using self-antigen dsDNA in various doses to pristane induced lupus (PIL) Balb/c mice towards Th2 cell percentages, IL-4 levels, and IFNγ/IL-4 ratio. This research uses true experimental study design in laboratory with post-test-only control group design. Samples were selected using simple random sampling method. Balb/c female mice 6-8 weeks old and 20-30 grams body weight separated randomly to negative control group (healthy mice) and pristane induced lupus (PIL) mice group. PIL mice groups were injected 0.5 cc (782μg / ml) pristane intraperitoneally. Twelve weeks after the injection of pristane, the mice were evaluated for clinical and serological manifestations (anti-dsDNA levels). Mice with lupus signs (PIL mice) were divided into four groups; positive control group: PIL mice without EDI dsDNA therapy, treatment A: PIL mice with EDI dsDNA therapy dose I (0.01 μg/ml, 0.1 μg/ml, 1 μg/ml), treatment B: PIL mice with EDI dsDNA therapy dose dose II (0.1 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml), and treatment C: PIL mice with EDI dsDNA therapy dose III (1 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml) was administered once every week respectively. In addition, dsDNA has complexed with the cationic polymer polyethylenimine (PEI)2 before injection. This study was measured some variables including percentages of Th2 cells in spleen mice using flowcytometry method and IL-4 and IFN-γ levels measured using ELISA (eBioscience). The data obtained were analyzed first using the normality and homogenicity test of variance with confidence level of 95%. Comparable tests performed by One Way ANOVA test if the data were normal distributed and homogenous and Kruskal Wallis test if the data were not normally distributed and or not homogeneous. Analysis can be continued post hoc test to know the differences between groups. The results of this study showed that a single dose of IP dose injection could induce signs of lupus including weight loss, hair loss, decreased activity and significantly increased anti-dsDNA levels. The results showed that the average percentage of Th2 cells in treatment group A (3.28 ± 0.64), B (3.31% ± 1.12), and C (3.44% ± 0.52) tended to decrease compared to positive group (K+) (4.31% ± 0.39) although not significant. IL4 Levels in treatment A (3.17 ± 0.42, p = 0.037), B (4.22 ± 3.61, p = 0.024), and C (5.02 ± 3.42; p = 0.005) tends to increase compared to positive group (1.60 ± 0.51) significantly (p <0.05). The IFN-γ/IL-4 ratio in treatment group A (3601.11 ± 1070.77, p = 0.003), B (2934.61 ± 1083.00; p = 0.001) and C (2953.56 ± 1584.28; p = 0.001) decreased significantly when compared to positive group (K+) (7814.15 ± 2331.95) suggesting dsDNA EDI therapy may decrease the IFNγ/IL-4 ratio.In this study, EDI dsDNA in the PIL mice group could decrease the number of Th2 cells through increased T-Reg cells and production of IL-10 and TGF-β immunomodulatory cytokines. In previous studies, administration of immunotherapy with specific antigens with EDI methods was shown to induce T-Reg activation and function for IL-10 and TGF-β cytokine secretion that work suppresses autoreactive immune cells. T-Reg cells have an important role in the development of tolerance therapy with specific antigens and induction of IL10 cytokines as immunomodulators Increased levels of IL-4 in PIL mice due to EDI dsDNA therapy are suspected not only because of the production of IL-4 by Th2 cells but also the production of other cells such as mast cells, basophils, and B cells. This increase in levels of IL-4 suggested as a regulator to suppress excess activity of Th1 cells. Th1 activity is one of them characterized by the production of IFN-γ. Th2 also produces IL-4 cytokines that are antagonistic to IFN-γ and suppress macrophage activation. Th2 activity may function as a physiological regulator of the immune response by inhibiting the potentially harmful effects of Th1 responses. The decrease in IFN-γ/IL-4 ratio in PIL mice given dsDNA EDI therapy explains the increased IL-4 measurement results in this study. Increased levels of IL-4 in the mice group treated with dsDNA EDI were thought to be compensatory for suppressing the production of IFN-γ lupus cytokines. Restoring the balance of IFN-γ and IL-4 production is expected to be a target of therapy to inhibit organ damage to LES and in this study, EDI dsDNA therapy in PIL mice successfully restored the IFN-γ/IL-4 balance to approximately normal mice. As conclusion, EDI administration of dsDNA could not reduce IL-4 levels in PIL mice and the effect of EDI dsDNA on PIL mice showed decreased in Th2 cell count and IFN-γ/IL-4 ratio dose group II (0.1 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml) as the best dose.

Item Type:	Thesis (Magister)
Identification Number:	TES/616.772/HAR/e/2018/041803778
Subjects:	600 Technology (Applied sciences) > 616 Diseases > 616.7 Diseases of musculoskeletal system > 616.77 Diseases of connectives tissues > 616.772 Systemic lupus erythematosus
Divisions:	S2/S3 > Magister Ilmu Biomedis, Fakultas Kedokteran
Depositing User:	Sugeng Moelyono
Date Deposited:	24 Aug 2022 01:35
Last Modified:	24 Aug 2022 01:35
URI:	http://repository.ub.ac.id/id/eprint/193475

Text KHOIRUNISAH DWI HARTANTI.pdf Download (4MB)

Actions (login required)

View Item