Potensi Vaksin Lectin-Like Oxidized Ldl Receptor-1 (Lox-1) Dalam Mencegah Aterosklerosis: Studi Efek Vaksin Dna Lox-1 Dalam Mencegah Pembentukan Sel Busa Pada Aorta Tikus Wistar Dan Vaksin Subunit Lox-1 Dalam Mencegah Deposisi Lipid Pada Abdominal Mesenteric Artery Shr-Sp

Yurina, Valentina and Prof. Dr.dr. Kusworini Handono,, M.Kes, Sp.PK. and Prof. Dr.dr. Achmad Rudijanto,, Sp.PD. KEMD –FINASIM and Dr. rer. nat. Tri Yudani Mardining Raras,, M.App.Sc (2018) Potensi Vaksin Lectin-Like Oxidized Ldl Receptor-1 (Lox-1) Dalam Mencegah Aterosklerosis: Studi Efek Vaksin Dna Lox-1 Dalam Mencegah Pembentukan Sel Busa Pada Aorta Tikus Wistar Dan Vaksin Subunit Lox-1 Dalam Mencegah Deposisi Lipid Pada Abdominal Mesenteric Artery Shr-Sp. Doktor thesis, Universitas Brawijaya.

Abstract

Aterosklerosis adalah proses keradangan kronis yang dapat mengarah pada terjadinya berbagai komplikasi seperti misalnya penyakit kardiovaskular. Hingga saat ini penyakit kardiovaskular masih menjadi penyebab utama kematian di dunia dan prevelansinya semakin meningkat di negara berkembang seiring dengan perubahan gaya hidup. Aterosklerosis diawali dengan ambilan LDL teroksidasi (ox-LDL) ke dalam sel endotel yang diperantarai oleh reseptornya. Lectin like oxidized-LDL receptor-1 (LOX-1) merupakan reseptor utama ox-LDL berupa protein homodimer yang diekspresikan berlebih akibat berbagai stimulus, misalnya ox-LDL dan stres oksidatif. Ikatan antara ox- LDL dan LOX-1 akan memicu jalur pensinyalan dalam sel yang berakibat pada aktivasi dan disfungsi sel endotel, yang teridentifikasi melalui peningkatan produksi reactive oxygen species (ROS) intraselular, penurunan Nitric Oxide (NO), dan aktivasi faktor transkripsi nuclear faktor kappa beta (NF-Κβ). Selanjutnya, aktivasi NF-Κβ diikuti dengan peningkatan ekspresi sitokin, molekul adhesin, dan protease. Melihat sentralnya peran LOX-1 dalam aterosklerosis, penghambatan LOX-1 menjadi salah satu strategi terapi aterosklerosis baru yang potensial. Vaksinasi merupakan salah satu terapi pencegahan aterosklerosis yang mulai dikembangkan. Penelitian pengembangan vaksin LOX-1 dibagi dalam dua tahap, yaitu penelitian tahap I berupa pengembangan vaksin DNA rekombinan dengan menggunakan region penyandi C-type like domain (CTLD)-LOX-1 yang dibawa plasmid pcDNA3.1. Vaksin DNA ini diberikan dengan menggunakan adjuvan alum melalui rute injeksi intramuskuler. Penelitian tahap II merupakan pengembangan vaksin protein subunit yang diproduksi menggunakan teknologi DNA rekombinan yaitu dengan memproduksi antigen CTLD-LOX-1 pada sel inang Lactococcus lactis NZ9000. Selain sebagai produsen protein sub-unit CTLD LOX-1, L.lactis juga dimanfaatkan sebagai bakteri pembawa vaksin yang diberikan melalui rute oral. Pada penelitian tahap I, untuk mengembangkan vaksin DNA LOX-1 dilakukan construct dengan menyisipkan gen penyandi CTLD LOX-1 tikus pada plasmid pembawa (pcDNA3.1). LOX-1 diuji ekspresinya secara in vitro pada sel mamalia (sel HeLa). CTLD- LOX-1 disintetik secara kimia dan digabungkan dengan gen penyandi green fluorescence protein (GFP) dengan menggunakan pcDNA3.1 sebagai plasmid pembawa. Plasmid pcDNA3.1-LOX-1 dan pcDNA3.1-GFP-LOX-1 ditransfeksikan ke dalam sel HeLa dengan metode lipotransfeksi. Analisa ekspresi mRNA LOX-1 dan GFP-LOX-1 lebih tinggi pada sel HeLa yang ditransfeksi dengan pLOX-1 ( ̴ 300x) dan pGFP-LOX-1 ( ̴ 275.000 kali) daripada sel HeLA yang tidak ditransfeksi. Ekspresi protein LOX-1 pada sel HeLa yang ditransfeksi dengan pLOX-1 terdeteksi pada ukuran 14 kDa yang menunjukkan ukuran CTLD-LOX-1. Hal ini menunjukkan bahwa plasmid pcDNA3.1-LOX-1 dikenali oleh sistem mamalia dan dapat digunakan sebagai kandidat vaksin pada hewan coba. Selanjutnya vaksin LOX-1 diuji efektivitasnya dalam mencegah aterosklerosis dengan menggunakan alum sebagai adjuvan melalui rute intramuskuler. Adjuvan berupa alum yang digunakan berperan sebagai sistem depot yang meningkatkan waktu retensi vaksin pada lokasi pemberian sehingga memicu akumulasi antigen presenting cells (APC). Dalam penelitian ini terlihat bahwa vaksin DNA-LOX-1 v mampu mencegah kerusakan struktur intima media aorta pada tikus Wistar dengan diet tinggi lemak yang ditunjukkan dengan struktur sel otot polos yang normal dan minimnya jumlah infiltrasi mononuclear dan sel busa. Vaksin DNA LOX-1 juga sedikit mencegah peningkatan ekspresi LOX-1 (p= 0, 371) pada sel endotel jaringan aorta tikus yang dianalisa dengan teknik immunofluorescense. Analisa imunohistokimia menunjukkan bahwa vaksin DNA LOX-1 tampak mencegah penurunan ekspresi eNOS (p = 0,419) pada sel endotel jaringan aorta tikus. Lebih lanjut vaksin DNA LOX-1 juga diduga mencegah pembentukan sel busa (p =0.096) pada jaringan aorta tikus. Penelitian pendukung juga menunjukkan bahwa vaksin LOX-1 mampu mencegah inflamasi pada aorta tikus melalui pencegahan ekspresi NF-kB, TNF-α, dan IL-6. Vaksin LOX-1 tidak menginduksi peningkatan produksi antibodi anti-LOX-1 sehingga diduga vaksin LOX-1 bekerja melalui sistem imun selular. Pada penelitian tahap II, vaksin subunit LOX-1 dibawa oleh L. lactis rekombinan sebagai pembawa. LOX-1 diekspresikan secara in vitro di dalam sel L. lactis rekombinan sebagai protein fusi dengan GFP. Analisa Western Blot menunjukkan LOX-1 diproduksi melalui induksi nisin. L. lactis yang mengekspresikan LOX-1 diberikan pada hewan coba spontaneous hypertensive rats-stroke prone (SHR-SP) melalui rute oral. Level antibodi IgG anti-LOX-1 lebih tinggi secara signifikan pada tikus yang divaksinasi dibandingkan dengan tikus kontrol (p = 0,046). Anti LOX-1 mencegah pengikatan ox-LDL dengan LOX- 1 sehingga mencegah disfungsi endotel. Vaksin subunit LOX-1 mampu meningkatkan respon imun humoral melalui induksi produksi antibodi IgG anti-LOX-1. Walaupun demikian, titer antibodi tidak cukup tinggi untuk dapat memblok LOX-1 secara keseluruhan sehingga area disposisi lipid pada tikus yang divaksin tidak turun secara signifikan (p = 0,232). Kesimpulan dari penelitian ini adalah LOX-1 merupakan protein yang potensial untuk dikembangkan sebagai kandidat vaksin anti aterosklerosis, baik melalui pendekatan vaksin DNA maupun vaksin subunit. Walaupun demikian perlu dilakukan optimasi dosis, rute pemberian, dan formulasi adjuvan untuk meningkatkan respon imun sehingga dapat mencegah kerusakan struktur sel endotel pada jaringan aorta dan pembentukan plak aterosklerosis

English Abstract

Atherosclerosis is a chronic inflammatory condition that leads to various fatal complications such as cardiovascular diseases. At present, cardiovascular diseases are still the leading cause of mortality in the world and its prevalence is increasing in developing countries along with lifestyle changes. Atherosclerosis is initiated with oxidized LDL (ox-LDL) uptake into endothelial cells mediated by their receptors. Lectin-like oxidized-LDL receptor-1 (LOX-1) is the main receptor of ox-LDL which expression is induced by various stimuli, such as ox-LDL and oxidative stress. The binding between ox-LDL and LOX-1 triggers cell signaling pathways that result in endothelial cell activation and dysfunction, identified through increased intracellular reactive oxygen species (ROS) production, decreased Nitric Oxide (NO), and activation of nuclear factor kappa beta (NF-Kβ) transcription factor. Furthermore, activation of NF-Kβ is followed by increased expression of cytokines, adhesion molecules, and proteases. Given the central role of LOX-1 in atherosclerosis, LOX-1 inhibition becomes one of the potential new atherosclerosis therapeutic candidates. Prevention of atherosclerosis using vaccination is a promising approach. The study was divided into two steps, the first study was to develop DNA recombinant vaccine with C-type lectin-like domain (CTLD) LOX-1 combined with the pcDNA3.1 plasmid. The DNA vaccine was given intramuscularly using alum as the adjuvant. The second study was a subunit vaccine development. The subunit vaccine was developed using Lactococcus lactis NZ9000 as the host cell to produce CTLD-LOX-1 protein. L. lactis was also used as the carrier to bring the vaccine through the oral route. The LOX-1 vaccine is a promising atherosclerosis vaccine candidate. In the first step of the study, the LOX-1 DNA vaccine was constructed by inserting a C-type like- domain (CTLD) LOX-1 rat gene on a carrier plasmid. The in vitro expression was assayed on mammalian cells (HeLa cells). CTLD-LOX-1 was synthesized chemically and combined with the gene encoding green fluorescence protein (GFP) using pcDNA3.1. Plasmid pcDNA3.1-LOX-1 and pcDNA3.1-GFP-LOX-1 were transfected into HeLa cells using lipotransfection method. Measurement of LOX-1 and GFP-LOX-1 mRNA expression using qRT-PCR demonstrated that the mRNA expression was higher in HeLa cells transfected with pLOX-1 (̴ 300x) and pGFP-LOX-1 (̴ 275,000 times) than mRNA expression in non-transfected HeLa cells. The expression of the LOX-1 protein in pLOX- 1 transfected HeLa cells was detected at 14kDa size, indicating the correct CTLD-LOX-1 size. This result suggests that the pcDNA3.1LOX-1 plasmid is recognized by the mammalian expression system and can be used as a vaccine candidate in experimental animals. The LOX-1 DNA vaccine was assayed for its effectiveness in preventing atherosclerosis using alum as adjuvant given by intramuscular route. Alum adjuvant acts as a depot system that increases vaccine retention time at the administrative sites to trigger the accumulation of antigen presenting cells (APC). In this study, the LOX-1 DNA vaccine demonstrated to inhibit the structural damage of the aortic intima-media in Wistar rats fed with a high-fat diet, demonstrated by the normal smooth muscle-cells structure and the minimal amount of mononuclear infiltration. The LOX-1 DNA vaccine also slightly prevented the expression of LOX-1 (p=0.317) in the endothelial cells. Immunohistochemistry staining revealed that the LOX-1 DNA vaccine slightly inhibited vii the eNOS reduction in the endothelial cells (p = 0.419). LOX-1 DNA vaccine slightly inhibited the foam cells formation (p=0.096). Studies also show that LOX-1 DNA vaccine was able to prevent inflammation in rat aorta through the prevention of NF-kB, TNF-α, and IL-6 expression. The LOX-1 vaccine did not induce the anti-LOX-1 antibody production, thus it is expected that the LOX-1 vaccine works through the cellular immune system. In the second step of the study, the subunit LOX-1 vaccine was carried by recombinant L. lactis as a delivery vector. LOX-1 is expressed in recombinant L. lactis cells. Western Blot analysis showed that LOX-1 was overexpressed through nisin induction. L. lactis expressing LOX-1 was administered to spontaneous hypertensive rats- stroke prone (SHR-SP) via the oral route. Anti LOX-1 prevents the binding of ox-LDL with LOX-1 thus preventing endothelial dysfunction. The subunit LOX-1 vaccine is capable of enhancing humoral immune response through induction of IgG anti-LOX-1 production. IgG anti-LOX-1 level was higher in the vaccinated rats compared to the IgG level in the control group (p=0.046). However, the antibody titer was not high enough to completely block LOX-1 so that the lipid deposition area in the vaccinated rats did not decrease significantly (p=0.232). The conclusion of this study is that LOX-1 is a potential protein to be developed as a candidate for anti-atherosclerosis vaccine, either through a DNA vaccine approach or a subunit vaccine because both of them demonstrated the efficacy to prevent the foam cells formation or lipid deposition. However, it is necessary to optimize the dosage, route of administration, and adjuvant formulation to improve the immune response so that it can prevent atherosclerosis effectively

Other obstract

-

Item Type:	Thesis (Doktor)
Identification Number:	DIS/615/71/FK/p/2018/061809619
Subjects:	600 Technology (Applied sciences) > 615 Pharmacology and therapeutics > 615.7 Pharmacokinetics > 615.71 Drugs affecting cardiovascular and hematopoietic systems / Cardiovascular agents
Divisions:	S2/S3 > Doktor Ilmu Kedokteran, Fakultas Kedokteran
Depositing User:	Nur Cholis
Date Deposited:	23 Aug 2022 04:02
Last Modified:	23 Aug 2022 04:02
URI:	http://repository.ub.ac.id/id/eprint/193442

Text VALENTINA YURINA.pdf Download (8MB)

Actions (login required)

View Item