Pengaruh Pemberian Vaksin Kinoid IL-17A terhadap Kadar Anti-dsDNA dan Jumlah Sel Plasma pada Mencit Model Lupus Eritematosus Sistemik.

Hermawan, Hanestya Oky (2018) Pengaruh Pemberian Vaksin Kinoid IL-17A terhadap Kadar Anti-dsDNA dan Jumlah Sel Plasma pada Mencit Model Lupus Eritematosus Sistemik. Magister thesis, Universitas Brawijaya.

Abstract

Lupus Eritematosus Sistemik (LES) adalah penyakit autoimun yang ditandai dengan keradangan sistemik yang kronis dan melibatkan kerusakan multi organ. Angka kejadian LES di seluruh dunia diperkirakan mencapai sekitar 5 juta orang dan 200.000 kasus diantaranya terjadi di Indonesia. Angka morbiditas dan mortalitas LES semakin tinggi di negara berkembang, termasuk Indonesia. Selain itu, penderita LES didominasi oleh wanita yang masih berada dalam usia produktif. Hal ini akan berdampak terhadap menurunnya tingkat produktifitas penderitanya dan dapat berlanjut pada terganggunya aspek sosial dan ekonomi di keluarga serta masyarakat LES diakibatkan oleh sistem imun yang bereaksi secara berlebihan (hipereaktif) terhadap antigen sendiri yang mengakibatkan reaksi inflamasi sistemik dan kerusakan pada berbagai organ. Berbagai penelitian membuktikan bahwa pasien LES mengalami abnormalitas regulasi sistem imun yang ditandai dengan adanya peningkatan jumlah sel plasma pada darah tepi yang berkorelasi dengan kadar autoantibodi anti-dsDNA. Anti- dsDNA yang dihasilkan oleh sel plasma yang autoreaktif inilah yang berperan dalam munculnya berbagai macam manifestasi klinis LES. Hal ini membuat sel plasma dan anti- dsDNA berpotensi untuk dijadikan target terapi untuk memperbaiki manifestasi klinis LES. Penelitian lain menunjukkan bahwa terdapat sitokin proinflamasi yang berperan penting dalam pathogenesis LES yaitu Interleukin (IL)-17A. IL-17A adalah sitokin yang banyak diproduksi oleh sel Th17 yang berperan untuk mempengaruhi aktivitas komponen sistem imun lain di dalam tubuh salah satunya adalah aktivasi dan diferensiasi dari sel B menjadi sel plasma sehingga akan memproduksi autoantibodi ANA dan anti-dsDNA. Peningkatan kadar IL-17A dalam tubuh berhubungan dengan tingkat keparahan manifestasi klinis LES seperti lupus nefritis dan timbulnya flare. Vaksin kinoid adalah vaksin yang dibuat dari derivat sitokin yang telah diproses sedemikian rupa untuk menghilangkan aktivitas biologisnya namun masih bersifat imunogen sehingga mampu merangsang aktivasi sistem imun. Pemberian vaksin ini bertujuan untuk menginduksi dan meningkatkan pembentukan antibodi yang dapat menetralisir sitokin terkait sehingga dapat menekan penumpukan sitokin yang mengalami overproduksi. Penelitian ini menggunakan desain eksperimen murni (true experimental design) di laboratorium secara in vivo dengan menggunakan rancangan Randomized Post Test Only Controlled Group Design. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui bahwa vaksin kinoid IL-17A mampu memperbaiki regulasi sistem imun melalui penurunan jumlah sel plasma lien dan kadar anti dsDNA serum pada mencit model Pristane-induced Lupus (PIL). Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit strain Balb/c betina. 26 Mencit yang memenuhi syarat kriteria inklusi diaklimatisasi selama 1 minggu kemudian dibagi menjadi 2 grup yaitu grup 1 (berisi 7 mencit) tanpa perlakuan apapun dan grup 2 (berisi 19 mencit) yang diberikan injeksi pristane dengan dosis 0.5 mL secara intraperitoneal untuk membuat hewan coba model PIL. Kemudian pada minggu ke-8 setelah injeksi pristane, 3 mencit yang diambil dari masing-masing grup dikorbankan sebagai sampel untuk diukur kadar Anti Nuclear Antibody (ANA) dan proteinuria. Pengukuran tersebut bertujuan untuk menilai keberhasilan pembuatan hewan coba model PIL yang ditunjukkan dengan kadar ANA dan proteinuria yang positif. Kemudian hewan coba dikelompokkan kembali dimana hewan coba pada grup 1 akan menjadi kelompok kontrol negatif (KN) (4 mencit) sedangkan grup 2 dibagi menjadi 4 kelompok yaitu kontrol positif (KP), perlakuan 1 (P1), perlakuan 2 (P2) dan perlakuan 3 (P3) yang masing-masing berisi 4 mencit. Pada kelompok P1, P2 dan P3 diberikan perlakuan berupa injeksi vaksin kinoid IL-17A, yaitu protein recombinant IL-17A yang dikonjugasikan dengan Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH) dengan metode aldehyde, secara intramuskular dengan dosis vaksin 125 μg/ml pada P1, 250 μg/ml pada P2, dan 500 μg/ml pada P3. Vaksin kinoid IL- 17A diberikan sebanyak 3 kali yaitu pada hari ke-0, 21 dan 42. Setelah hari ke-60 sejak pemberian vaksin kinoid IL-17A hari pertama, semua mencit dibedah untuk diambil serum dan lien. Jumlah sel plasma pada organ lien diukur menggunakan flow cytometry dengan penanda permukaan CD19+ CD38+. Kadar anti-dsDNA diukur pada serum menggunakan metode sandwich ELISA. Kemudian data dianalisa statistik menggunakan metode one way ANOVA dan korelasi Pearson. Hasil penelitian menunjukkan bahwa mencit yang diinjeksi pristane selama 8 minggu telah menunjukkan kadar ANA dan proteinuria yang yang positif. Jumlah sel plasma diukur menggunakan pemeriksaan flow-cytometry dengan satuan persen (%) pada hasil pengukurannya. Sel plasma merupakan sel yang mengekspresikan CD19+ dan CD38+. Analisis uji beda dilakukan dengan menggunakan One Way Anova, karena terdapat lebih dari 2 kelompok dengan variabel numerik dan memiliki sebaran data yang normal (p=0.108) dan homogen. Pada hasil uji Anova, didapatkan nilai p=0.000. Jumlah sel plasma pada KP (47.09 ± 3.77%) meningkat secara signifikan jika dibandingkan dengan KN (27.71 ± 1.72%, p=0.000). Setelah pemberian vaksin kinoid, terdapat penurunan yang tidak signifikan pada grup P1 (41.62 ± 2.16%, p=0.050) jika dibandingkan dengan grup KP. Penurunan jumlah sel plasma yang signifikan ditemukan pada grup P2 (28.33 ± 1.70%, p=0.000) dan P3 (30.09 ± 2.58%, p=0.000) jika dibandingkan dengan grup KP. Efek dosis vaksin terhadap penurunan jumlah sel plasma yang terbaik adalah dosis P2 (250 μg/ml). Pada P3 (dosis 500 μg/ml) jumlah sel plasma meningkat kembali jika dibandingkan dengan P2. Kadar anti dsDNA pada serum diukur menggunakan ELISA dengan satuan μg/ml pada hasil pengukurannya. Analisis uji beda dilakukan dengan menggunakan One Way Anova, karena terdapat lebih dari 2 kelompok dengan variabel numerik dan memiliki sebaran data yang normal (p=0.726) dan homogen. Pada hasil uji Anova, didapatkan nilai p=0.000. Kadar anti-dsDNA pada serum meningkat secara signifikan pada KP (0.650 ± 0.01) dibandingkan dengan KN (0.517 ± 0.01, p=0.000). Kadar anti-dsDNA menurun pada P1 (0.597 ± 0.02, p=0.005); P2 (0.544 ± 0.16, p=0.000); dan P3 (0.611 ± 0.01, p=0.040) secara signifikan jika dibandingkan dengan KP. Efek dosis vaksin terhadap penurunan kadar anti-dsDNA yang terbaik adalah dosis P2 (250 μg/ml). Pada P3 (dosis 500 μg/ml) kadar anti-dsDNA meningkat kembali jika dibandingkan dengan P2. Korelasi Pearson antara jumlah sel plasma dan kadar anti dsDNA menghasilkan signifikansi p=0.000 yang menunjukan bahwa korelasi antara jumlah sel plasma dan kadar anti dsDNA adalah bermakna dan r= 0.708, menunjukan korelasi positif dengan kekuatan korelasi kuat. Dari hasil penelitian diatas dapat disimpulkan bahwa pemberian vaksin kinoid IL- 17A mampu memperbaiki regulasi sistem imun pada mencit model Pristane Induced Lupus (PIL) yang ditunjukkan dengan adanya penurunan jumlah sel plasma pada lien dan kadar anti-dsDNA serum.

English Abstract

Systemic Lupus Erythematosus (SLE) is an autoimmune disease characterized by chronic systemic inflammation and involves multiple organ damage. The incidence of SLE across the world is estimated at about 5 million people, and 200,000 of these cases occurred in Indonesia. SLE morbidity and mortality rates higher in developing countries, including Indonesia. Moreover, SLE patients are dominated by women who are still in their productive age. It will impact to decreasing level of patients productivity and can lead to the disruption of social and economic aspects in the family and society. SLE caused by the immune system that reacts excessively or hyperreactive against its own antigens that result in systemic inflammatory reaction and damages to various organs. Various studies have shown that SLE patients have immune response abnormalities that increase in the number of plasma cells that correlate with levels of anti- dsDNA autoantibodies. The anti-dsDNA produced by this autoreactive plasma cell plays a role in various clinical manifestations of SLE. This allows plasma cells and anti-dsDNA to be targeted for therapy to improve SLE clinical manifestations. Other studies have shown that there are proinflammatory cytokines that play an important role in the pathogenesis of SLE. The cytokine is Interleukin (IL) -17A. IL-17A is a cytokine that is widely produced by Th17 cells that play a role to influence the activity of other immune system components in the body one of which is the activation and differentiation of B cells into plasma cells that will produce ANA and anti-dsDNA autoantibodies. Increased levels of IL-17A in the body are related to the severity of clinical manifestations of SLE such as lupus nephritis and the onset of flares. Kinoid vaccine is a vaccine made from derivatives of cytokines that have been processed in such a way as to eliminate its biological activity but still immunogen that can stimulates the immune system activation. This vaccine aimed to induce and enhance the formation of antibodies that can neutralize related cytokine that can reduce the abundance of experiencing overproduction of cytokines. This vaccine has been used in a variety of diseases based on inflammatory reaction. This study was a true experimental study in vivo at laboratory. This study design was post-test only group design. This study aimed to determine that IL-17A kinoid vaccine was able to improve immune system regulation in Pristane Induced Lupus (PIL) mice model as indicated by the decrease of plasma cell count in mice and serum anti-dsDNA levels. The experimental animals used in this study were female mice Balb/c strains. 26 mice eligible for inclusion criteria acclimatized for 1 week then subdivided into 2 groups. Group 1 (containing 7 mice) without any treatment and group 2 (containing 19 mice) given pristane injection with a dose of 0.5 mL intraperitoneally to make PIL mice model. Then, at week 8 after pristane injection, 3 mice taken from each group were sacrificed as samples for measured levels of Anti Nuclear Antibody (ANA) and proteinuria. The measurements were aimed at assessing the success of PIL modeled animal models demonstrated with positive ANA and proteinuria levels. Then the experimental animals were grouped again where experimental animals in group 1 would be the negative control group (KN) (4 mice) while group 2 was divided into 4 groups: positive control (KP), treatment 1 (P1), treatment 2 (P2) and treatment 3 (P3) each containing 4 mice. In the P1, P2 and P3 groups were administered an IL-17A kinoid vaccine, the recombinant IL-17A protein conjugated with Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH) by aldehyde method, intramuscularly with a dose of 125 μg/ml vaccine at P1, 250 μg/ml at P2, and 500 μg/ml at P3. The IL-17A kinoid vaccine was administered 3 times on days 0, 21 and 42. After the 60th day after the initial IL-17A kinoid vaccine, all mice were dissected for serum and spleen preparations. The number of plasma cells in the spleen was measured using flow cytometry with a CD19 + CD38 + surface marker. Anti-dsDNA levels were measured on serum using the ELISA sandwich method. Then the data were analyzed statistically using one way ANOVA method and Pearson correlation. The results showed that mice injected by pristane for 8 weeks had shown positive levels of ANA and proteinuria. The number of plasma cells was measured using flow- cytometry examination with percent unit (%) in the measurement result. Plasma cells are cells that express CD19 + and CD38 +. The results were analyzed using One Way Anova, as there were more than 2 groups with numerical variables and had normal data distribution (p = 0.108) and homogeneous. Anova test results, obtained a significance value of p=0.000. The plasma cell count in KP (47.09 ± 3.77%) increased significantly when compared to KN (27.71 ± 1.72%, p = 0.000). After the administration of the kinoid vaccine, there was an insignificant decrease in group P1 (41.62 ± 2.16%, p = 0.050) when compared to the KP group. Significant decrease in plasma cell counts was found in the P2 group (28.33 ± 1.70%, p = 0.000) and P3 (30.09 ± 2.58%, p = 0.000) when compared to the KP group. The best dose effect of vaccine in lowering plasma cell count is the dose of P2 (250 μg/ml). At P3 (dose 500 μg/ml) plasma cell counts rise again when compared to P2. Serum anti dsDNA levels were measured using ELISA with μg/ml units in the measurement results. Different test analyzes were performed using One Way Anova, as there were more than 2 groups with numerical variables and had normal data distribution (p = 0.726) and homogeneous. Anova test results, obtained a significance value of p=0.000. Levels of anti-dsDNA in serum increased significantly in KP (0.650 ± 0.01) compared with KN (0.517 ± 0.01, p = 0.000). Anti-dsDNA levels decreased at P1 (0.597 ± 0.02, p = 0.005); P2 (0.544 ± 0.16, p = 0.000); and P3 (0.611 ± 0.01, p = 0.040) significantly when compared to KP. The best dose effect of vaccine in lowering anti-dsDNA levels is the dose of P2 (250 μg/ml). At P3 (dose 500 μg/ml) anti-dsDNA levels rise again when compared to P2. The Pearson correlation between plasma cell count and anti dsDNA levels resulted in a significance of p = 0.000 which showed that the correlation between plasma cell count and anti dsDNA levels was significant and r = 0.708, indicating a strong positive correlation between them. From that results it can be concluded that IL-17A kinoid vaccine was able to improve immune system regulation in Pristane Induced Lupus (PIL) mice model as indicated by the decrease of plasma cell count in spleen and serum anti-dsDNA level.

Other obstract

-

Item Type:	Thesis (Magister)
Identification Number:	TES/616.772/HER/p/2018/041802336
Uncontrolled Keywords:	-
Subjects:	600 Technology (Applied sciences) > 616 Diseases > 616.7 Diseases of musculoskeletal system > 616.77 Diseases of connectives tissues > 616.772 Systemic lupus erythematosus
Divisions:	S2/S3 > Magister Ilmu Biomedis, Fakultas Kedokteran
Depositing User:	Endang Susworini
Date Deposited:	19 Jul 2022 02:10
Last Modified:	19 Jul 2022 02:10
URI:	http://repository.ub.ac.id/id/eprint/192245

Text Hanestya Oky Hermawan.pdf Download (6MB)

Actions (login required)

View Item