Efek Afzelin Terhadap Penghambatan Migrasi Dan Peningkatan Apoptosis Sel Kanker Payudara Mda-Mb 231, Melalui Hambatan Fak Dan Rac-1

Rachmi, Eva (2019) Efek Afzelin Terhadap Penghambatan Migrasi Dan Peningkatan Apoptosis Sel Kanker Payudara Mda-Mb 231, Melalui Hambatan Fak Dan Rac-1. Doctor thesis, Universitas Brawijaya.

Abstract

Rendahnya angka harapan hidup pasien kanker payudara berhubungan erat dengan metastasis, karena menyebabkan gagalnya fungsi organ vital dan menghasilkan klonal yang resisten dan agresif. Hal ini menunjukkan terapi kanker payudara tidak cukup hanya menargetkan pada tumor primer melalui pendekatan sitotoksik tetapi juga perlu dikembangkan penghambat invasi dan metastasis. Penghambatan metastasis menjadi tantangan karena tiap tahapan dalam cascade ini membutuhkan unsur dan kondisi yang berbeda. Pada hampir semua tahapan metastasis terdapat karakteristik yang sama yaitu kemampuan sel metastatik untuk migrasi, yang dapat menjadi target dalam menghambat metastasis. Tanpa memandang pemicunya, pemegang peran kunci migrasi sel kanker adalah pensinyalan integrin, yang mengaktifkan pembentukan protrusi sel dan focal adhesion. Focal adhesion dibentuk oleh sekitar 200 protein, dengan salah satu komponen enzimatik kunci yaitu focal adhesion kinase (FAK). Protein FAK tersebut meningkat ekspresinya pada kanker payudara, dan berhubungan dengan agresivitas dan prognosis yang buruk. Pembentukan protrusi sel berupa lamellipodia berperan sebagai traksi sel, yang regulasi utamanya diatur oleh Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1). Pada kanker payudara invasif, Rac1 mengalami over ekspresi yang dihubungkan dengan kebutuhan sel kanker untuk migrasi. Selain meningkatkan migrasi, overekspresi FAK dan Rac1 juga berhubungan dengan resistensi apoptosis pada sel kanker. Afzelin (kaempferol 3-O-rhamnosida) merupakan salah satu jenis flavonol glikosida. Kemampuan afzelin sebagai anti kanker ditunjukkan dengan kemampuannya menginduksi caspase cascade pada kanker prostat dan kanker payudara tipe luminal, serta menghambat proliferasi kanker prostat. Sebagaimana flavonoid, struktur inti afzelin yang mirip adenin menyebabkan afzelin menarik untuk dieksplorasi kemampuannya untuk menghambat fosforilasi protein FAK dan Rac-1, yang berperan dalam migrasi dan apoptosis sel. Oleh karena itu, penelitian ini ditujukan untuk membuktikan potensi afzelin dalam menghambat migrasi dan meningkatkan apoptosis kanker payudara subtipe triple negative (TNBC), yang merupakan jenis kanker payudara yang agresif dan metastatik. Sebagai model TNBC dipilih sel kanker payudara M.D. Anderson - Metastatic Breast-231 (MDA-MB 231). xi Pembuktian dilakukan secara in vitro dengan rancangan penelitian post-test only with control group design. Pengaruh pemberian afzelin pada MDA-MB 231 diukur pada hambatan penutupan zona bebas pada uji migrasi scratch wound closure, serta pembentukan adhesi fokal yang diamati melalui pewarnaan imunofluoresen di bawah miroskop konfokal. Efek afzelin pada apoptosis diukur dengan flow cytometry sel yang diwarnai annexin V/propidium iodide. Pengaruh afzelin terhadap kadar FAK teraktivasi diklarifikasi menggunakan Western blotting, sedangkan kadar Rac1 teraktivasi diamati menggunakan GLISA. Kecuali data focal adhesion yang bersifat kualitatif, hasil yang didapat adalah data kuantitatif yang selanjutnya diuji secara statistik melalui uji ANOVA dengan post hoc Tukey. Afzelin terbukti mampu menurunkan viabilitas sel MDA-MB-231 dengan IC50 992 μg/ml. Hasil ini sejalan dengan peningkatan apoptosis yang mengikuti peningkatan konsentrasi afzelin. Pada uji migrasi scratch wound closure, afzelin menghambat migrasi dua dimensi, yang dibuktikan dengan penurunan jumlah sel yang migrasi ke area bebas sel maupun penurunan persentase area yang tertutup sel pada jam ke-24 dan ke-48. Mekanisme inhibisi migrasi oleh afzelin dieksplorasi berdasar pembentukan focal adhesion yang ditandai oleh perubahan lokasi vinculin di tepi sel. Focal adhesion yang terbentuk tampak semakin samar dan kecil seiring dengan peningkatan konsentrasi afzelin, dengan kecenderungan yang sama dengan penurunan migrasi sel dua dimensi. Lebih lanjut, afzelin menurunkan ekspresi FAK dan FAK Tyr397 terfosforilasi secara bermakna dibanding kontrol negatif pada konsentrasi 800 μg/ml, serta menurunkan aktivasi Rac1 mulai konsentrasi yang lebih kecil yaitu 400 μg/ml. Dalam penelitian ini, peningkatan apoptosis berhubungan dengan penurunan ekspresi FAK dan p-FAK Tyr397 secara substansial, sehingga FAK dan aktivasinya diduga berperan penting dalam menyebabkan apoptosis. Penghambatan migrasi sel berhubungan secara moderat dengan penurunan ekspresi FAK dan penurunan aktivasi Rac1 tetapi berhubungan lemah dengan p-FAK Tyr397, yang memunculkan dugaan afzelin bekerja pada target lain dalam inhibisi migrasi selain menghambat kerja kinase FAK dalam autofosforilasi residu Tyr397. Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa afzelin berpotensi meningkatkan apoptosis dan menghambat migrasi pada TNBC yang memiliki karakteristik seperti sel MDA-MB-231, melalui penurunan p-FAK Tyr397 dan aktivasi Rac1.

English Abstract

The low survival rate of breast cancer patients is closely linked to metastasis, which causes the dysfunction of vital organs and produces resistant and aggressive clonal. This phenomenon shows that breast cancer therapy is not sufficient to just targeting primary tumors through cytotoxic approaches but also in urgent need to develop invasion and metastasis intervention. The inhibition of metastasis is challenging because each stage in this cascade requires different elements and conditions. Nevertheless, the migration ability of metastatic cells is a characteristic that exists in almost all stages, which can be targeted for metastasis inhibition. Regardless of the stimuli, the central player of cancer cell migration is integrin signaling, which activates the formation of cell protrusions and focal adhesion. Focal adhesion is formed by around 200 proteins, with focal adhesion kinase (FAK) as one of the enzymatic components. FAK and Rac1 also contribute to apoptosis resistance of cancer cells. The protein is overexpressed in breast cancer and associated with aggressiveness and poor prognosis. Cell protrusion formation in the form of lamellipodia provides cell traction, mainly regulated by Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1). Rac1 is overexpressed in invasive breast cancer, which correlates with cell migration requirements. Afzelin (kaempferol 3-O-rhamnoside) is one of the flavonol glycosides. The potency of afzelin as an anti-cancer was shown by its ability to induce caspase cascade in prostate cancer and luminal breast cancer, as well as inhibiting the proliferation of prostate cancer. Similar to another flavonoid, afzelin has a core structure that mimics adenine, which makes it a good candidate for inhibition of protein phosphorylation, particularly FAK and Rac-1. The inhibitory effect of afzelin should be observed directly at the protein level, but also need to be demonstrated at the cellular level in the form of apoptosis, migration, and focal adhesion formation. This study aimed to prove afzelin potential in inhibiting the migration of triple-negative breast cancer (TNBC), which is an aggressive and metastatic subtype of breast cancer. Medical doctor Anderson - metastatic breast-231 (MDA-MB-231) breast cancer cells selected as a model of TNBC. The investigation was conducted in vitro through the post-test only control group study design. Effect of afzelin to xiii MDA-MB 231 cell migration was evaluated on free zone closure during the scratch wound test, as well as focal adhesion formation that evaluated through immunofluorescent staining which observed under confocal microscopy. The effects of afzelin on apoptosis were measured by DNA ladder assay and flow cytometry of annexin V/propidium iodide-tagged cells. Afzelin's influence on activated FAK level was clarified using ELISA, while the levels of the activated Rac1 was observed using the G-LISA. Except focal adhesion formation which qualitatively analyzed, the rest dependent variables were be analyzed statistically by ANOVA, followed by Tukey post hoc analysis. Afzelin reduced the viability of MDA-MB-231 cells with IC50 992 μg/ml. These results were in line with the increase of apoptosis along with the increase of afzelin concentration. In the scratch wound closure migration test, afzelin inhibits two-dimensional migration, as demonstrated by the decrease of the number of cells in the cell-free areas and the decrease of the percentage of cell-covered areas at 24 and 48 hours. The mechanism of inhibition of migration by afzelin is explored based on the formation of focal adhesion which is characterized by re-location of vinculin at the cell edge. The focal adhesion that is formed appears to be increasingly equivocal and smaller with increasing afzelin concentration. Furthermore, afzelin significantly reduced FAK expression and FAK Tyr397 phosphorylated compared to negative controls at a concentration of 800 μg/ml and decreased Rac1 activation at a lower concentration of 400 μg/ml. In this study, the increase of apoptosis was substantially associated with the decrease of FAK expression and p-FAK Tyr397, hence FAK and its activation were thought to play an important role in the apoptosis mechanism. Inhibition of cell migration was moderately related to the decrease of FAK expression and the decrease of Rac1 activation but is weakly related to p-FAK Tyr397, which raises the possibility that afzelin acts on other targets in migration inhibition apart from inhibiting the action of FAK kinase in autophosphorylation of the Tyr397 residue. The conclusion of this study was afzelin has the potential to increase apoptosis and inhibit migration in TNBC which has similar characteristics as MDA-MB-231 cells, through the decrease of p-FAK Tyr397 and Rac1 activation.

Other obstract

-

Item Type:	Thesis (Doctor)
Identification Number:	DIS/615.321/RAC/e/2019/062000756
Uncontrolled Keywords:	DRUGS DERIVED FROM PLANTS
Subjects:	600 Technology (Applied sciences) > 615 Pharmacology and therapeutics > 615.3 Organics drugs > 615.32 Drugs derived from plants and mikroorganisms > 615.321 Drugs derived from plants
Divisions:	S2/S3 > Doktor Ilmu Kedokteran, Fakultas Kedokteran
Depositing User:	Endang Susworini
Date Deposited:	16 Feb 2021 07:58
Last Modified:	16 Feb 2021 07:58
URI:	http://repository.ub.ac.id/id/eprint/183311

Text Eva Rachmi.pdf Download (9MB)

Actions (login required)

View Item