Isolasi Dan Karakterisasi Fragmen Protein Human Thyroid Stimulating Hormone Receptor (Htshr-169) Rekombinan Untuk Mengenali Thyroid Stimulating Antibody (Tsab) Pada Penderita Graves’ Disease

Zulkarnain, - (2020) Isolasi Dan Karakterisasi Fragmen Protein Human Thyroid Stimulating Hormone Receptor (Htshr-169) Rekombinan Untuk Mengenali Thyroid Stimulating Antibody (Tsab) Pada Penderita Graves’ Disease. Doctor thesis, Universitas Brawijaya.

Abstract

Graves’ disease (GD) merupakan salah satu bentuk klinis dari kelainan respon imun pada tiroid yang sistemis, dan ditandai dengan terbentuknya autoantibody yang menyerang secara langsung thyroid stimulating hormone receptor (TSHR), atau dikenal sebagai thyroid stimulating antibody (TSAb). Hingga saat ini, kelainan GD masih menjadi penyebab utama hipertiroid pada populasi dunia. Akan tetapi, patogenesis terjadinya GD masih belum diketahui secara pasti. Beberapa hipotesis menunjukkan bahwa kelebihan suplementasi yodium dalam populasi dapat memicu oxidative stress sel limfosit dan respon imun pada tiroid, yang berakibat terjadinya hipertiroid autoimmune. Thyroid stimulating hormone receptor dikatakan sebagai autoantigen yang ditargetkan pada GD. Bagian subunit-A (ekstraseluler) dari TSHR merupakan daerah immunogenic utama yang berperan penting dalam menstimulasi maturitas afinitas dari antibodi pada kelainan GD. Adapun fragmen hTSHR-169 (residu 36-169) yang telah diidentifikasi sebagai bagian subunit-A yang bersifat non-polimorfik (conserved region) dan antigenic, memiliki kemampuan untuk berinteraksi secara spesifik dengan TSAb berdasarkan molecular docking analysis. Karakteristik yang dimiliki oleh struktur protein hTSHR-169 dalam ikatan kompleks antigen-antibodi, sangat berpotensi untuk dikembangkan sebagai kandidat serodiagnostic biomarker berbasiskan antigen untuk mengenali dan mendeteksi keberadaan TSAb dalam serum penderita GD. Walaupun keberadaan TSAb telah menjadi dasar utama dalam mendiagnosis GD, namun keterbatasan fasilitas laboratorium di daerah terpencil dan biaya pemeriksaan yang relatif mahal menjadi pertimbangan klinisi untuk tidak melakukan pemeriksaan antibodi tersebut secara rutin. Inovasi kandidat serodiagnostic biomarker berbasiskan antigen hTSHR-169 dalam bentuk rapid test diharapkan dapat menjadi solusi alternatif yang ekonomis dan memudahkan klinisi dalam menegakkan diagnosis GD secara definitif. Pengembangan rekayasa protein hTSHR-169 sebagai kandidat serodiagnostic biomarker dituangkan dalam tiga tahapan penelitian. Penelitian tahap pertama bertujuan untuk membuktikan dan memastikan secara komputasi (in silico) bahwa model antigen hTSHR-169 yang telah didesain mampu berinteraksi dan berikatan secara spesifik dengan model TSAb (M22 Fab). Pada penelitian tahap kedua yang dilakukan secara in vitro, bertujuan untuk mengekspresikan protein hTSHR-169 dalam sistem ekspresi bakteri E.coli BL21 (DE3) dan menguji interaksinya dengan TSAb dalam serum penderita GD. Pada tahapan terakhir, dilakukan validitas internal melalui pengujian spesifisitas dan sensitivitas protein hTSHR-169 rekombinan untuk mengenali TSAb dalam serum penderita GD dibandingkan gold standard (ELISA). Analisis conserved region dan epitope mapping secara komputasional pada penelitian tahap I merupakan langkah awal dalam mengidentifikasi dan menyeleksi fragmen hTSHR-169 yang bersifat non-polimorfik dan antigenic. Melalui pendekatan homology modeling, dilakukan prediksi dan validasi model struktur tiga dimensi dari hTSHR-169 agar sesuai dengan struktur aslinya. Selanjutnya dilakukan pengujian interaksi model hTSHR-169 dengan model antibodi M22 Fab melalui molecular docking analysis dan dynamic molecular simulation. Prediksi interaksi asam amino dan energi afinitas yang terbentuk dari kompleks hTSHR169-M22 dievaluasi dan dibandingkan dengan model referensi (TSHR260-M22). Lebih dari 50% asam amino yang berinteraksi secara non-covalent (ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik dan electrostatic) pada kedua kompleks memiliki kesamaan. Walaupun memiliki panjang urutan asam amino yang lebih xi pendek sekitar 51% dibandingkan model referensi, namun energi afinitas yang dimiliki keduanya tidak jauh berbeda, berturut-turut -10,2 Kcal/mol dan -11,9 kcal/mol untuk hTSHR169-M22 dan hTSHR260-M22. Pola pergerakan interaksi dan perubahan sudut struktur yang terjadi saat membentuk ikatan kompleks juga dievaluasi melalui molecular dynamic simulation. Hasilnya menunjukkan bahwa stabilitas ikatan protein hTSHR-169 dalam kompleks hTSHR169-M22 sangat baik, dengan nilai RMSD akhir berturut-turut 2,3 Å dan 2,4 Å untuk hTSHR-169 dan TSAb. Pemilihan vektor ekspresi pET28a dan sel inang E.coli BL21 (DE3) dalam penelitian tahap kedua bertujuan mengoptimalkan ekspresivitas protein hTSHR-169. Protein hTSHR-169 telah berhasil diekspresikan dalam medium LB broth setelah 4 jam induksi IPTG 0,1 mM pada suhu 37 0C. Hasil purifikasi melalui metode kromatografi afinitas berlabel his-tag, diperoleh produk protein hTSHR-169 yang fungsional (soluble) mencapai 350 μg/mL. Produk purifikasi berhasil direaksikan dan dikenali oleh antibodi TSAb yang terdapat dalam serum penderita GD, dengan membentuk pita tunggal ~16,8 kDa pada analisis western blotting. Produk metabolit bakteri berupa protein agregat (inclusion body) juga berhasil disolubilisasi dan di-refolding menggunakan urea 8 M menjadi protein yang fungsional. Selanjutnya pengujian validitas internal protein hTSHR- 169 rekombinan melalui metode dot blot menunjukkan hasil spesifisitas 70% dan sensitivitas 80% saat bereaksi dengan TSAb yang terdapat dalam serum penderita GD. Hasil validitas awal ini perlu ditingkatkan lagi melalui evaluasi stabilitas protein hTSHR- 169 rekombinan selama penyimpanan dan pengoptimalan immunoreactivity antigen melalui metode pengujian yang lebih spesifik seperti western blot dan ELISA. Kesimpulan dari keseluruhan penelitian ini adalah didapatkan protein hTSHR-169 rekombinan yang sangat potensial untuk dikembangkan sebagai kandidat serodiagnostic biomarker berbasiskan antigen, yang mampu mendeteksi keberadaan TSAb secara spesifik dan sensitif pada penderita kelainan respon imun pada tiroid, khususnya Graves’ disease.

English Abstract

Graves’ disease (GD) is a clinical form of systemic autoimmune thyroid disease, characterized by autoantibodies formation directed against the thyroid stimulating hormone receptor (TSHR), or called thyroid-stimulating autoantibodies (TSAb’s). Thus far, GD is the most common cause of hyperthyroidism in population. However, the pathomechanism of GD is still unknown. Some hypotheses reveal that excess iodine intake in population can induce the oxidative stress in lymphocytes and thyroid autoimmunity, which results in the autoimmune hyperthyroidism. Thyroid stimulating hormone receptor is main autoantigen in GD. Subunit-A or extracellular domain of TSHR is major immunogenic region that drive affinity maturation of autoantibodies in the Graves’ disease. The hTSHR-169 fragments (residues 36-169) has been identified as a conserved region of subunit-A and antigenic peptides, its capable to specifically interact with TSAb based on molecular docking analysis. The characteristic of hTSHR-169 structure in the complex is very promising to be developed as an antigen-based serodiagnostic biomarker for recognizing and detection of TSAb in the Graves’ sera. The presence of TSAb is used to establish the definitive diagnosis for GD. However, the unavailability of laboratory facilities in district area and relatively expensive cost for service are the clinicians’ consideration to measure this antibody as routine procedures. Inovation of hTSHR-169 as antigen-based serodiagnostic biomarker is expected to be an inexpensive and easy tool for diagnosis of GD. The development of recombinant hTSHR-169 protein as a serodiagnostic biomarker was divided into three stages of research. The first study aims to computationally prove and ensure that hTSHR-169 model is able to interact and bind specifically to the TSAb model (M22 Fab). The second study was conducted by in vitro. The purpose of this step is to express the hTSHR-169 in the E.coli BL21(DE3) bacterial expression system and verify its binding to TSAb in the Graves’ sera. Furthermore, in the final stage of study, internal validity was carried out through specificity and sensitivity testing of recombinant in recognizing the TSAb in Graves’ sera compared to the gold standard (ELISA). Analysis of the conserved region and epitope mapping were the first step computationally to identify and select the non-polymorphic sequences and antigenic region of hTSHR-169. Prediction and validation of the three dimensional structure was conducted through homology modeling approach. Then, interaction between hTSHR-169 model and antibody model (M22 Fab) were analyzed by the molecular docking analysis and dynamic molecular simulation. Prediction of amino acid binding and affinity energy were evaluated and compared with reference model (TSHR260-M22). More than 50% of amino acids that interact non-covalently (hydrogen bond, hydrophobic and electrostatic interaction) in the both complexes have similar binding. Although hTSHR-169 has 51% sequence length shorther than the reference model, both have affinity energy slightly different, about -10,2 Kcal/mol and -11,9 Kcal/mol for hTSHR169-M22 and reference model, respectively. The motion pattern of interaction and structural changes in complex were also evaluated through the molecular dynamic simulation. The results were showed that stability of hTSHR-169 protein in complex was very good (favorable), with final RMSD scores of 2,3 Å and 2,4 Å for hTSHR-169 dan TSAb, respectively. The determination of pET28 expression vector and E.coli BL21(DE3) as a host are to optimize the expression of hTSHR-169 protein. This protein was successfully xiii expressed in LB broth medium after 4 hours of 0,1 mM IPTG induction at 37 0C. The purification using his-tag affinity chromatography method was obtained the soluble hTSHR-169 protein up to 350 μg/mL. Furthermore, purification yields were successfully interacted and recognized by TSAb in Graves’ sera, which is marked by a single band of 16,8 kDa. Bacterial metabolite products that form aggregate proteins (inclusion body) have also been successfully solubilized and refolded by 8 M urea into the functional proteins. Hereinafter, internal validity of recombinant proteins through dot blot analysis were represented about 70% and 80% for specificity and sensitivity, respectively. This initial validity need to be enhanced through evaluating recombinant stability in storage and optimizing antigen immunoreactivity with specific methods such as Western blotting and ELISA. In conclusion, the recombinant hTSHR-169 could be developed as a potential protein for antigen-based serodiagnostic biomarker to detect TSAb specifically and sensitive in patients’ sera with autoimmune thyroid disease, especially Graves’ disease.

Other obstract

-

Item Type:	Thesis (Doctor)
Identification Number:	DIS/616.443/ZUL/i/2020/062002740
Uncontrolled Keywords:	HYPERTHYROIDISM
Subjects:	600 Technology (Applied sciences) > 616 Diseases > 616.4 Diseases of endocrine, hematopoietic, lymphatic, glandular system; diseases of male breast > 616.443 Hyperthyroidism
Divisions:	S2/S3 > Doktor Ilmu Kedokteran, Fakultas Kedokteran
Depositing User:	Endang Susworini
Date Deposited:	16 Feb 2021 04:08
Last Modified:	09 Oct 2024 03:16
URI:	http://repository.ub.ac.id/id/eprint/183266

Text Zulkarnain_unlocked (1).pdf Download (10MB)

Actions (login required)

View Item