Mustika, Dewi (2014) Paparan Glukosa Tinggi Menurunkan Aktivitas Neuron Dopaminergik dan Meningkatkan Apoptosis Sel Otak melalui Jalur Sinyal Estrogen pada Embrio Zebrafish (Danio rerio). Magister thesis, Universitas Brawijaya.
Abstract
Wanita hamil dengan diabetes mellitus memiliki resiko lebih tinggi untuk terjadinya aborsi spontan pada trimester pertama kehamilan serta terjadinya malformasi fetus mayor akibat paparan kondisi hiperglikemia. Salah satu kelainan yang diketahui ditimbulkan oleh hiperglikemia berkepanjangan selama masa perkembangan adalah malformasi pada otak janin. Hipotesis yang berkembang saat ini mengenai etiologi dari malformasi pada diabetes melitus adalah kelainan apoptosis yang diinduksi oleh hiperglikemia. Oleh karena itu muncul dugaan bahwa peningkatan apoptosis pada otak akibat hiperglikemia bertanggungjawab atas terjadinya malformasi otak pada masa perkembangan. Penelitian ini memfokuskan pada keterlibatan sinyal estrogen dalam mekanisme apoptosis pada otak yang diinduksi oleh kondisi hiperglikemia menggunakan embrio zebrafish (Danio rerio) sebagai hewan coba. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk membuktikan bahwa paparan glukosa tinggi dapat menyebabkan penurunan ekspresi reseptor estrogen dan brain-formed estrogen, sehingga terjadi aktivasi jalur apoptosis secara langsung, maupun melalui down-regulation dari ekspresi glucose transporter-1 (GLUT1). Perubahan dari sinyal estrogen pada otak berdampak pada down-regulation aktivitas dopaminergik berupa penurunan ekspresi Tyrosine hydroxylase serta motilitas dari embrio. Embrio zebrafish dipapar glukosa 1 %, 3 %, dan 5 % mulai 24 hpf (hours post-fertilization) sampai akhir penelitian. RT-PCR, Whole-mount Immunofluorescence, dan Acridine orange staining dilakukan untuk mengetahui efek paparan glukosa pada ekspresi mRNA dari beberapa gen terkait glucoregulation dan sinyal estrogen, ekspresi Tyrosine hydroxylase (TH), dan apoptosis sel otak. Studi ini menunjukkan bahwa paparan glukosa tinggi meningkatkan ekspresi insulin, reseptor insulin, dan GLUT1 pada 48 jam setelah fertilisasi (hpf) kemudian tidak berubah atau menurun pada 96 hpf. Hal ini menunjukkan bahwa hiperglikemia terjadi pada embrio 96 hpf akibat kondisi hipoinsulinemia. Sehingga dapat disimpulkan bahwa hiperglikemia terjadi oleh karena peningkatan paparan glukosa gagal diikuti oleh peningkatan ekspresi insulin dan reseptornya. Modulasi sinyal estrogen di otak setelah paparan glukosa ditunjukkan oleh perubahan ekspresi mRNA reseptor estrogen (ER) dan brain-aromatase (aromB) serta didukung oleh penurunan fungsinya dalam mengatur aktivitas dopaminergik. Paparan glukosa tinggi menyebabkan peningkatan ekspresi aromB, ER–α, ER–β1, dan ER–β2 pada 48 hpf dan sebaliknya menurunkan secara dose-dependent manner pada 96 hpf. Hal ini mengindikasikan bahwa pengaruh paparan glukosa terhadap ekspresi estrogen signaling related gene tergantung pada konsentrasi dan lamanya paparan glukosa. Terbukti bahwa kondisi hiperglikemia-hipoinsulinemia pada 96 hpf memiliki potensi menurunkan ekspresi ER dan aromB. Sedangkan penurunan aktivitas dopaminergik ditunjukkan oleh penurunan yang signifikan dari ekspresi TH pada diencephalon serta respon terhadap rangsangan taktil. Pewarnaan Acridine orange menunjukkan peningkatan apoptosis sel otak yang signifikan pada embrio 96 hpf yang terpapar glukosa 3 % dan 5 %. Hal ini mengkonfirmasi hasil beberapa penelitian sebelumnya bahwa kondisi hiperglikemia dapat mengaktivasi jalur apoptosis. Selain itu, penelitian ini membuktikan suatu hipotesis bahwa penurunan sinyal estrogen akibat paparan glukosa dapat menstimulasi peningkatan apoptosis karena terganggunya fungsi estrogen sebagai anti-apoptosis. Untuk mengkonfirmasi bahwa peningkatan apoptosis sel otak berkaitan langsung dengan down-regulation aromB dan ER, dilakukan ko-inkubasi dengan E2. Peningkatan apoptosis dapat dicegah oleh koinkubasi estrogen (E2) 0,1 dan 1 μM membuktikan bahwa modulasi sinyal estrogen berperan dalam proses apoptosis yang diinduksi oleh kondisi hiperglikemia. Selain itu, koinkubasi E2 ini diketahui juga dapat mencegah penurunan ekspresi mRNA glucose transporter-1 (GLUT1) akibat paparan glukosa 5%. Pengaruh E2 dapat dicegah dengan penambahan inhibitor reseptor estrogen, 10 μM ICI, menunjukkan efek E2 diperantarai oleh ER. Down-regulation sinyal estrogen yang juga melibatkan penurunan ekspresi GLUT1 setelah paparan glukosa yang tinggi terbukti menginduksi apoptosis sel otak sehingga menyebabkan penurunan ukuran kepala embrio sebagai indikator hambatan perkembangan otak embrio. Secara keseluruhan, penelitian ini mengidentifikasi mekanisme terjadinya apoptosis pada otak yang diinduksi oleh kondisi hiperglikemia melalui paparan glukosa selama awal perkembangan zebrafish. Pertama, ditunjukkan bahwa desain penelitian ini menghasilkan embrio dengan hipoinsulinemia-hiperglikemia pada 96 hpf dan menyebabkan ukuran kepala embrio lebih kecil akibat terjadinya peningkatan apoptosis pada otak. Peningkatan apoptosis ini terjadi melalui down-regulation sinyal estrogen yang ditandai dengan penurunan ekspresi ER dan brain aromatase sehingga terjadi aktivasi jalur apoptosis. Salah satu jalur apoptosis akibat penurunan sinyal estrogen ini adalah melalui down-regulation ekspresi GLUT1. Selain itu, modulasi sinyal estrogen ini berpotensi menyebabkan down-regulation ekspresi TH pada 48 hpf dan menurunkan aktivitas lokomotor pada 72 hpf. Hal ini menandakan bahwa paparan glukosa menurunkan aktivitas dopaminergik pada otak embrio yang sedang berkembang.
English Abstract
Pregnant women with diabetes mellitus are at increased risk for both first-trimester spontaneous abortions and major fetal malformations. One of anomalies known to be elicited by prolonged hyperglycemia during development is malformation in fetal brain caused by impairment of apoptosis. Since emerging hypo sis for etiology of diabetes-associated malformations is hyperglycemia-induced apoptosis, this is suggested that increasing brain apoptosis seems has responsibility to fetal brain malformation in hyperglycemia condition. In this study we focused on involvement of estrogen signaling in mechanism of hyperglycemia-induced apoptosis in brain using zebrafish embrios (Danio rerio) as a model. Hyperglycemia can be reliably induced in embryo of zebrafish by exposing with glucose. Besides that, zebrafish has been extensively used to study apoptotic cell death during normal development and under conditions of cellular stress. We estimated that high glucose exposure could induce brain apoptosis in zebrafish embryo possibly by alteration in glucose transporter-1 expression which might be regulated through estrogen signaling. Zebrafish embrios were exposed to 1%, 3%, and 5% of glucose from 24 hpf (hour post-fertilization) till end of experiments. RT-PCR, Whole-mount Immunofluorescence, and Acridine orange staining were conducted to reveal effect of glucose exposure on mRNA expression of some glucoregulation and estrogen signaling related genes, Tyrosine hydroxylase (TH) expression, and apoptosis in brain respectively. This study showed that glucose exposure increased mRNA expression of insulin and insulin receptor at 48 hpf and n unchanged or even decreased at 96 hpf for 5% glucose, suggesting that hyperglycemia possibly occurred in condition of hypoinsulinemia at 96 hpf. It could be concluded from that hyperglycemia may be caused by insulin deficiency when increase in glucose exposure is failed to be followed by increase in insulin and its receptor expression. modulation of estrogen signaling in brain after glucose exposure was indicated by alteration of estrogen receptor (ER) and brain aromatase mRNA expression and also supported by impairment of its function regulating dopaminergic activity. Glucose exposure altered expression of ER and brain aromatase mRNA depend on glucose concentration and duration of exposure. In first 24 hours (48 hpf embryos), glucose exposure stimulated increasing estrogen signaling mRNA expression including brain aromatase (P450 aromB), ER – α, ER – β1 and ER – β2 at 48 hpf. Conversely, glucose exposure, especially 3% and 5% of glucose, decreased se estrogen signaling mRNA at 96 hpf. Clearly, hyperglycemic- hypoinsulinemic state occured at 96 hpf have potency to decrease expression of aromB and both of ER. Impairment of dopaminergic activity was demonstrated by significant reduction of TH expression in diencephalon and respond to tactile stimulation. Acridine orange staining showed a significant increase in brain-specific apoptosis followed by decreasing embryo head size at 96 hpf embryos exposed to 3% and 5% glucose. We hypo sized that decreasing of estrogen signaling possibly stimulate increasing of apoptosis because of its function as anti-apoptotic could diminish. This result showed that increasing apoptosis and decreasing embryo head size occurred when hyperglycemia caused down-regulation of aromB and ER mRNA expression. To confirm our result that significant increase in brain-specific apoptosis is related to down regulation of brain aromatase and ER, we did ano r experiment with E2 co-incubation and also ER blocker, ICI (10 μM). By this experiment we figured out that increasing of apoptosis in brain could be prevented by co-incubation with 0.1 μM E2. effect of E2 was reversed by addition of 10 μM ICI, suggesting anti-apoptotic effect of E2 was mediated through estrogen receptor. Fur r, this E2 co-incubation also could prevent partially decreasing of Glucose Transporter-1 (GLUT -1) mRNA expression due to 5% glucose exposure. Taken toge r, se results suggested that high glucose exposure induces brain-specific apoptosis and smaller head size in zebrafish embrio possibly by down regulation of estrogen signaling involving alteration in GLUT1 expression. In summary, this study identified mechanisms of hyperglycemia-induced apoptosis in brain during early development of zebrafish by exposing with high glucose concentration. First we showed that this experimental design produce hypoinsulinemic-hyperglycemic embryo at 96 hpf and lead abnormal smaller embryo`s head related to increasing brain-specific apoptosis. Increasing apoptosis is possibly occurred via alteration of estrogen signaling, characterized by decreasing expression of ER and aromB at 96 hpf, resulting apoptosis pathway activation, including through down-regulating GLUT1 expression. This study establishes basic understanding for fur r investigation of diabetes complication in fetal brain and improving better management for this disease.
| Item Type: | Thesis (Magister) |
|---|---|
| Identification Number: | TES/616.462/MUS/p/041401876 |
| Subjects: | 600 Technology (Applied sciences) > 616 Diseases > 616.4 Diseases of endocrine, hematopoietic, lymphatic, glandular system; diseases of male breast |
| Divisions: | S2/S3 > Magister Ilmu Biomedis, Fakultas Kedokteran |
| Depositing User: | Hasbi |
| Date Deposited: | 14 Apr 2014 09:51 |
| Last Modified: | 14 Apr 2014 09:51 |
| URI: | http://repository.ub.ac.id/id/eprint/158367 |
Actions (login required)
 |
View Item |