Setyawan, Erlangga (2014) Optimasi Enzim Retriksi (Ecori, Hindiii, Tasi) Dalam Metode Caps (Cleaved Amplified Polymorphics Sequence) Dengan Menggunakan Marka Mtssr Untuk Identifikasi Genetik Populasi Jeruk F1 Hasil Fusi Proto. Sarjana thesis, Universitas Brawijaya.
Abstract
Jeruk ialah tanaman buah komersial terpenting di dunia, dan dapat tumbuh pada wilayah subtropik maupun tropis. Buah jeruk menjadi peringkat pertama dalam pasar buah internasional (Food and Agriculture Organization of the United Nations Annual Statistics, 2003 dalam Chen et al., 2007). Indonesia termasuk Negara pengimpor jerukter besarkedua di ASEAN setelah Malaysia, dengan volume imporkhususnya jeruk manis sebesar 127.041 ton selama kurun waktu 2005 – 2009 dengan rata-rata per tahun mencapai 25.408 ton. Sedangkan untuk jenis keprok atau mandarin, selama kurun waktu 2005 – 2009 mencapai 504.063 ton atau sekitar 100.813 ton per tahun (BPS, 2010). Peningkatan impor buah jeruk merupakan suatu indikator belum mampunya jeruk local bersaing dengan jeruk impor baik dalam kualitas mapupun kuantitas. Salah satu jenis jeruk local komersial yang memiliki potensi tinggi adalah jeruk Siam Madu. Jeruk siam ini memiliki karakter kulit buah tipis, berwarna kuning, rasa manis, kandungan jus tinggi dan mampu beradaptasi pada dataran rendah dan tinggi. Namun untuk menjadikan jeruk Siam Madu sebagai jeruk yang mampu bersaing dengan jeruk impor diperlukan perbaikan terhadap kualitasnya terutama pada karakter jumlah biji. Jeruk Siam Madu memiliki jumlah biji yang cukup tinggi yaitu antara 10-15 biji per buah. Perbaikan kualitas biji jeruk Siam Madu dapat dilakukan dengan memindahkan sifat tanpa biji (seedless) dari jeruk lain. Salah satu jenis jeruk yang memiliki sifat seedless adalah Mandarin Satsuma. Jeruk Mandarin Satsuma memiliki karakter kuat yaitu tanpa biji yang disebabkan polennya yang steril (Male Steril – MS) dan diketahui dikendalikan oleh gen yang berada pada sitoplasmanya (Citoplasmic Male Sterility – CMS). Berdasarkan fakta tersebut, pemindahan sifat seedless dari Mandarin Satsuma tidak dapat dilakukan melalui persilangan biasa, tetapi dapat dilakukan melalui teknologi fusi protoplasma (hibridisasi somatik). Identifikasi dan karakterisasi merupakan bagian dari seleksi dan sangat penting dilakukan setelah tanaman hasil pemuliaan diperoleh. Pada tanaman hasil fusi protoplasma (fusan), seleksi awal sangat diperlukan untuk mengetahui keberhasilan fusi protoplasma yang dilakukan. Secara genetik, tanaman fusan memiliki perbedaan dengan tanaman hasil persilangan seksual karena memiliki berbagai kemungkinan diantaranya ialah adanya perpindahan / transfer, pencampuran / mixing, dan penggabungan ulang/recombination genom dan sitoplasma (Olivares-Fuster, 2007). Interaksi genom inti DNA inti - sitoplasma (DNA mitokondria dan kloroplas) dua tetua dan senyawa yang dihasilkan dari interaksi tersebut dapat memberikan efek yang nyata pada pertumbuhan, perkembangan dan performa tanaman fusan. Telah diketahui bahwa genom sitoplasma mengontrol beberapa cirri agronomis tanaman seperti tinggi tanaman, diameter batang, besar daun dan jumlah biji. Banyak studi tentang interaksi genom inti – sitoplasma tergantung kepada informasi rinci komposisi persilangan somatik (fusi protoplasma) melalui marka pengamatan morfologi, sitologi, dan genetik. Namun untuk mengerti interaksi antara inti - inti, inti - sitoplasma, dan sitoplasma – sitoplasma antara kedua fusi parental, penggunaan marka genetika atau molekuler lebih tepat. Marka molekuler ialah alat yang efektif karena deteksinya berdasarkan variasi genetik, yang tidak dipengaruhi lingkungan (Pabendon et al., 2005). Penanda molekuler merupakan teknik yang efektif dalam analisis genetic dan telah diaplikasikan secara luas dalam program pemuliaan tanaman. Penanda biokimia seperti isozim dan storage protein merupakan produk ekspresi gen yang telah diaplikasikan untuk identifikasi bibit hasil perkecambahan biji dan studi hubungan kekerabatan antar gene dan antar spesies pada tanaman jeruk. Walaupun demikian, penggunaan penanda biokimia mempunyai keterbatasan, yaitu umur tanaman berpengaruh terhadap pola pita yang dihasilkan. Disamping itu, penanda biokimia menghasilkan polimorfisme yang terbatas, sehingga sulit untuk membedakan kultivar yang berkerabat dekat (Karsinah et al., 2002; Pabendon, 2004). Analisis molekuler dapat juga menjadi kondusif untuk korelasi fenotipik atau cirri spesifik dengan komposisi nuclear dan sitoplasmik dari hibrid yang baru (Guo et al., 2008). Untuk analisis molekuler tersebut, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) dan RFLP (Restriction Fragment length Polymorphism) telah digunakan secara luas (Moreira et al., 2000; Guoet al., 2002), tetapi sejak perkembangan penanda molekuler yang lebih efisien dan sederhana seperti SSR (Simple Sequence Repeat), CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) dan kloroplas SSR (cpSSR), identifikasi hasil fusi dapat dilakukan dengan lebih mudah dan cepat. Marka CAPS telah banyak dimanfaatkan dalam proses verifikasi dan identifikasi tanaman fusan jeruk (Guo et al., 2008). Marka CAPS merupakan marka dalam metode gabungan antara RFLP dengan PCR. Metode ini dilaporkan telah berhasil digunakan untuk analisa DNA mitokondria (mtDNA) tanaman fusan jeruk oleh beberapa peneliti (Guo et al., 2008). Cai et al. (2009) lebih jauh melaporkan metode CAPS dengan primer universal untuk identifikasi mtDNA berhasil menunjukan adanya perbedaan band antara tetua dan tanaman fusannya. Tujuan kegiatan penelitian ini ialah untuk memperoleh informasi kombinasi dari primer dan enzim retriksi yang paling tepat dan memunculkan frekuensi polimorfisme yang tinggi pada tanaman sampel baik parentalnya maupun hasil fusi protplasmanya berdasarkan penanda molekuler mitokondria (mtSSR) dengan metode CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence). Penelitian ini akan dilaksanakan dari bulan April-Juni 2013 di Laboratorium pemuliaan Balai Penelitian Tanaman Jeruk dan Buah Subtropika (BALITJESTRO) Tlekung, Kecamatan Junrejo, Kota Batu.. Alat yang digunakan ialah mortar, pestel, gelas ukur, erlenmeyer, timer, beaker glass, stirrer, mikropipet, timbangan analitik, vortex, tabung eppendorf, mesin spektofotometer, autoclave, waterbath, mesin centrifuge, mesin elektroforesis, mesin PCR dan alat biodoc analyze. Bahan yang digunakan ialah daun muda dari 50 tanaman jeruk fusan dan kedua parentalnya (Siam Madu dan Mandarin Satsuma), aquadest, alcohol 70%, mercaptoethanol, pvp (polyvinyl pyrrolidone 10), buffer ekstrasi, ammonium asetat, CTAB (CetylTrimethyl Ammonium Bromide), Chlroform:Isoamylalcohol (24:1) (CHISAM), ethanol dingin, isopropanol dingin, buffer TE, buffer pencuci, RNAse (Roche), ethanol 96 % dingin, Agarose SPI (Duchefa Biochemie), Agarose Molecular Screening (Roche), buffer TBE, PCR mix (Fast Start PCR Master, Roche), Aqua bidestilata steril (Ikapharmindo), DNA ladder 100 bp (Promega), Ethidium Bromide (EtBr), loading dye (Fermentasi; Promega) dan menggunakan 2 pasang primer mtSSR (forwarddanreverse) yaitu primer 18S rRNA-5S rRNA dan nad1 exonB-nad 1 exon C (Latharet al., 2010). Metode Kerja Hasil penelitian menunjukkan kombinasi antara enzim retriksi ecoRI dengan primer 18S_rRNA_F/R maupun dikombinasikan dengan primer nad 1 exon C/B terbukti tidak dapat memunculkan adanya kehadiran pola fragmen pada DNA sampel pada semua tingkat waktu perlakuan. Kombinasi antara enzim retriksi hindIII dengan primer 18S_rRNA_F/R terbukti tidak dapat memunculkan adanya kehadiran pola fragmen pada DNA sampel pada semua tingkat waktu perlakuan, sedangkan ketika dikombinasikan dengan primer nad 1 exon C/B terdapat kehadiran pola fragmen pada DNA sampel pada tingkat waktu perlakuan T1(3jam), T2(6jam) dan T3(9jam), sedangkan kombinasi paling baik ialah kombinasi antara enzim retriksi tasI dengan primer 18S_rRNA_F/R dan primer nad 1 exon C/B, hal ini dikarenakan konsistensinya memunculkan kehadiran pola fragmen DNA sampel dengan baik pada kedua pasangan primers pada perlaku
English Abstract
Orange represent one of the horticulture commodity that functioning as source of nutrients, source of earnings, and State resource of stock-exchange. Indonesia is one of the biggest Importing country in orange in ASEAN after Malaysia, with volume of import especially sweet orange equal to 127.041 ton during range of time 2005 - 2009 with mean per year is 25.408 ton. While for the varieties of mandarin or keprok, during range of time 2005 - 2009 reaching 504.063 ton or about 100.813 ton per year. One of the commercial local orange type which have high potencials is Siam Madu varieties of orange. This siam have flimsy fruit husk character, rust colored, fine taste, obstetrical of high juice and can adapt at lowland and is high. One of the orange varieties that have nature of seedless is Mandarin Satsuma. Mandarin Satsuma have strong character that is seedless its caused a sterile pollen ( Sterile Male - MS) and known to be controlled by gene residing in sitoplasmic (Citoplasmic Male Sterility - CMS). Consider to the fact, removing the nature of seedless from Mandarin Satsuma to Siam Madu cant be done by conventional crossing, but it can be done by protoplasm fusion technology. Molekuler Marker is effective appliance because it is detecting by genetics variation, what do not influence by environment (Pabendon et al., 2005). Molekuler marker technique is effective techiques in analysis of genetics and applicated widely in plant breeding program. Biochemical marker example isozim and protein storage represent application gene expression product which have to identify seed result of germination of consanquinity relation study and seed between gene and between species at orange plant. Even though, usage of biochemical marker have limitation, that is plant age have an effect to yielded ribbon pattern. Beside, biochemical markers resulting limited polimorfisme, so that difficult to differentiate which varieties have a near consanquinity (Karsinah et al., 2002; Pabendon, 2004). To analyze the moleculer marker, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) and RFLP (Restriction Fragment length Polymorphism) used widely (Moreira et al., 2000; Guo et al., 2002), but after the advancing moleculer marker that more effisien and simple like SSR (Simple Sequence Repeat), CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) and chloroplast SSR (cpSSR), Identification of fusi can be done easier and quickly. CAPS marker used in verification process and identification of orange fusan (Guo et al., 2008). CAPS marker is a moleculer marker that combined between RFLP method and PCR. This methods reported success to use as mitochondria DNA analysis (mtDNA) of orange fusan by some reseacher (Guoet al., 2008). Cai et al. (2009) reported CAPS methods with universal primers to identification of mtDNA showed the different bands between parental and its fusan. Target of research is to get an information of the correct combinations between primers and restrictions enzyme that showed the highest polimorfism level in plant sample as good as its parental or its fusan based on mitochondria moleculer marker (mtSSR) by CAPS methode. The hypothesis are The combination between primers and restriction enzyme works significantly in certain time, that it can showed more bands in DNA sample or not. Work Place in Plant Breeding Laboratorium in BALITJESTRO, Junrejo District, Batu City, East Java. The research will be conducted at April – June 2013. The tools that used in this research are mortar, pestel, measure glass, erlenmeyer, timer, beaker-glass, stirrer, micropipet, analytic weighing-machine, vortex, eppendorf tube, machine of spectrofotometr, autoclave, waterbath, centrifuge-machine, elektroforesis-machine, PCR-machine and biodoc analyze. The materials that used in this research are Leaf sample of F1 and both of its parental (Siam Madu and Mandarin Satsuma), aquadest, alcohol 70%, mercaptoethanol, pvp (pyrrolidone polyvinyl), buffer-extraction, ammonium acetate, CTAB (CetylTrimethyl Ammonium Bromide), Chloroform:Isoamylalcohol (24:1) (CHISAM), cold-ethanol, cold-isopropanol, TE buffer, buffer-detergent, RNAse (Roche), cold-ethanol 96 % , Agarose SPI (DuchefaBiochemie), Agarose Molecular Screening (Roche), TBE buffer, PCR Mix (Fast Start PCR Master, Roche), Aqua of Bidestilata sterile, DNA Ladder 100 bp (Promega), Ethidium Bromide (Etbr), dye loading and use 2 primary tide of mtSSR that is 18S rRNA rRNA-5S and of nad1 exon B-nad 1 exon C. Workflow The result of this reserach are the combination of restriction enzymes ecoRI with primers 18S_rRNA_F / R and combined with the primer nad 1 exon C / B proved unable to bring the presence of the fragment patterns of DNA samples at all levels of treatment time. The combination of restriction enzymes hindIII with primer18S_rRNA_F / R proved unable to bring the presence of the fragment patterns of DNA samples at all levels of treatment time, whereas when combined with the primary nad 1 exon C / B there is the presence of the fragment patterns of DNA samples at the level of treatment time T1(3 hours), T2(6 hours) and T3(9 Hours). The best combination is a combination of restriction enzymes tasI with primer18S_rRNA_F / R and primer nad 1 exon C / B, this is because the consistency led to the presence of the DNA fragment patterns of the sample well on the second pair primers, then the analysis result of figure 7 and 8 showed mitochondrial of parental DNA fragment pattern identic or similar than mitochondrial of fusan DNA fragment pattern.
| Item Type: | Thesis (Sarjana) |
|---|---|
| Identification Number: | SKR/FP/2014/192/051404477 |
| Subjects: | 600 Technology (Applied sciences) > 631 Specific techniques; apparatus, equipment materials > 631.5 Cultivation and harvesting |
| Divisions: | Fakultas Pertanian > Budidaya Pertanian |
| Depositing User: | Hasbi |
| Date Deposited: | 12 Aug 2014 14:16 |
| Last Modified: | 09 Nov 2021 08:32 |
| URI: | http://repository.ub.ac.id/id/eprint/129646 |
Preview |
Text
ERLANGGA_SETYAWAN_(0910483011).pdf Download (5MB) | Preview |
Actions (login required)
 |
View Item |