Efek Penghambatan Wnt-catenin dan Ekspresi Betatrophin pada Sel Kanker Hepatokarsinoma (Hep G2) menggunakan Nanopartikel Kitosan Ekstrak Biji Moringa oleifera

Sholeh, Moch and Prof. Agustina Tri Endharti, S.Si., Ph.D and Hendra Susanto,, S.Pd., M.Kes., Ph.D (2024) Efek Penghambatan Wnt-catenin dan Ekspresi Betatrophin pada Sel Kanker Hepatokarsinoma (Hep G2) menggunakan Nanopartikel Kitosan Ekstrak Biji Moringa oleifera. Magister thesis, Universitas Brawijaya.

Abstract

Seiring masih cukup tingginya prevalensi HCC baik di Dunia maupun di Indonesia khususnya. Etiologi HCC secara umum adalah hepatitis C dan B kronik, fatty liver alkoholik dan non alkoholik, dan sindrom metabolik. Patogenesis HCC melibatkan hiperaktivasi beberapa jalur persinyalan seperti salah satunya Wnt/β-catenin. Pada penelitian ini juga menargetkan Betatrophin/ANGPTL8 yang telah diketahui berperan sebagai regulator metabolisme lipid. Namun, pada beberapa penelitian lain menyebutkan bahwa Betatrophin berperan dalam proliferasi kanker khususnya jalur Wnt melalui inhibisi WIF-1. Penelitian ini bertujuan untuk melihat bagaimana efek Nanokitosan Ekstrak Etanol Biji M. oleifera (MO) (NC-Mosee) terhadap ekspresi Betatrophin serta tingkat proliferasi pada sel kanker hati Hep G2 secara in-vitro. Penelitian ini tergolong in-vitro menggunakan sel Hep G2 serta perlakuan NCMosee serta terdapat perlakuan kombinasi juga dengan Doxorubicin sebagai kontrol positifnya dengan dosis IC50 8 µg/ml berdasarkan literasi pada sel Hep G2. Pada perlakuan kombinasi digunakan ½nya yakni 4 µg/ml saja lalu dikombinasikan dengan perlakuan NC-Mosee dosis bertingkat dimulai dari 15,75; 31,25; 62,5; 125; dan 250 µg/ml. Kemudian dilakukan skrining dosis IC50 melalui uji MTT dan uji Proliferasi untuk mengetahui waktu optimum inkubasi perlakuan. Setelah itu, dilakukan pengukuran secara genomik melalui RT-qPCR (perhitungan dengan Log 2 atau relative ekspresi gen) dan proteomik melalui Immunofluoresence. RT-qPCR mengukur Betatrophin, Wnt, β-catenin, CyclinD1, dan Caspase-3, sedangkan pada Immunofluoresence mengukur Betatrophin saja. Tidak lupa bahwa, penelitian ini menggunakan NC-Mosee yang telah dikonfirmasi sifat fisiknya melalui uji Particle Size Analyzer dengan ukuran 125,8 nm. Penggunaan kitosan menjadi penting dalam penelitian ini sebagai bahan penyalut senyawa biji Kelor. Mengingat bahwa kitosan juga memberikan interaksi elektrostatik yang kuat dengan muatan negatif DNA untuk membentuk nanopartikel dan secara efektif melindungi dari degradasi nuklease serta memnbantu internalisasi seluler senyawa yang dibawa. Diperoleh juga nilai zeta potensial 0,816 mV, terbukti cukup bagus bernilai positif. Nanopartikel dengan zeta potensial positif menunjukkan sebagai sifat suspensi yang stabil, karena muatan pada permukaan mencegah agregasi partikel. Senyawa yang dikandungnya juga telah dikarakterisasi melalui GC-MS dan diperoleh dominansi senyawa pada golongan polar Flavonoid (1529,97 µg/g) dan fenolik (187,37 µg/g), serta non-polar meliputi steroid (307,34 µg/g) dan triterpenoid (254,16 µg/g). Diperoleh dosis IC50 NC-Mosee sebesar 498 μg/mL, sedangkan pada kombinasi dosis IC50 sebesar 262 μg/mL + Doxorubicin 4 μg/mL. Waktu optimum dari uji Proliferasi yakni 48 jam. Melalui pengujian lebih lanjut secara genomik terbukti bahwa pemberian perlakuan NC-Mosee dengan dosis baru sebesar 300, 400, & 500 μg/mL serta diberi terapi kombinasi perlakuan NC-Mosee 262 μg/mL + Dox 4 μg/mL menurun secara signifikan pada marker Betatrophin, Wnt, β-catenin, dan CyclinD1, dan meningkat pada marker efektor apoptosis Caspase-3. Hal ini juga dikonfirmasi secara proteomik melalui uji Immunofluoresence bahwa terjadi penurunan viabilitas sel seiring meningkatnya dosis yang diberikan dengan ditunjukkan oleh nilai intensitas cahaya. Pada pengujian lanjut ini yang menggunakan 6 macam perlakuan (CN, CP, 300, 400, 500 μg/mL, serta 262 μg/mL + Doxorubicin 4 μg/mL) bahwa nilai setiap perlakuan terbukti signifikan pada uji lanjut Tukey. Adanya perlakuan NC-Mosee meningkatkan level sitotoksisitas pada sel kanker Hep G2 dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif. NC-Mosee menyebabkan terjadinya perubahan morfologi karakteristik sel hingga mengalami apoptosis pada sel kanker. Begitu pula pada kontrol positif dan perlakuan kombinasi melalui penghambatan topoisomerase II menggunakan Doxorubicin dan kinerja target NC-Mosee. AktivitasVII caspase terlihat meningkat dan diikuti menurunnya viabilitas sel. Semakin banyak kerusakan DNA yang terakumulasi, spheroid akan kehilangan integritas membrannya. Hal ini didukung dengan hasil pengecekan melalui imunofluoresense atau secara proteomik dengan menargetkan betatropin yang diduga berperan dalam kasus proliferasi kanker. Pada penelitian lain disebutkan bahwa peran Betatropin pada sel kanker pankreas adalah mengaktifkan jalur WIF-1 sehingga jalur sinyal proliferasi melalui Wnt dapat dihambat. Sebaliknya, pada penelitian ini menunjukkan bahwa tingkat ekspresi Betatropin menurun seiring dengan meningkatnya dosis NC-Mosee. Oleh karena itu, peran Betatropin dalam jalur persinyalan proliferasi ini perlu diteliti lebih lanjut mengingat masih kurangnya literasi mengenai hal ini. Pada literasi lain menyebutkan bahwa Betatrophin mampu emicu proliferasi sel HCC pada in-vitro dan in-vivo, serta Knockout Betatrophin mampu menghambat perkembangan HCC pada tikus dengan tumor HCC. Selanjutnya NC-Mosee mampu mengaktifkan efektor utama dalam proses apoptosis yaitu caspase-3 terbukti melalui analisis RT-qPCR terhadap ekspresi Caspase- 3. Mengingat bahwa Caspase-3 memainkan peran penting dalam mengaktifkan enzim pada jalur protease yang menginduksi apoptosis dan berhubungan dengan kematian sel. Peningkatan ini juga terjadi pada perlakuan kombinasi. Dimana penggunaan terapi kombinasi ini dengan tujuan untuk meminimalisir penggunaan obat generik itu sendiri. Mengingat bahwa cukup banyak ditemukan efek samping dari penggunaan obat tersebut.

English Abstract

As the prevalence of HCC is still quite high both in the world and in Indonesia in particular. The general etiology of HCC is chronic hepatitis C and B, alcoholic and nonalcoholic fatty liver, and metabolic syndrome. The pathogenesis of HCC involves hyperactivation of several signaling pathways, one of which is Wnt/β-catenin. This research also targets Betatrophin/ANGPTL8 which is known to act as a regulator of lipid metabolism. However, several other studies indicate that Betatrophin plays a role in cancer proliferation, especially the Wnt pathway through inhibition of WIF-1. This study aims to see the effect of M. oleifera (MO) Seed Ethanol Extract Nanochitosan (NC-Mosee) on Betatrophin expression and proliferation levels in Hep G2 liver cancer cells in vitro. This research is classified as in-vitro using Hep G2 cells and NC-Mosee treatment. There is also a combination treatment with Doxorubicin as a positive control with an IC50 dose of 8 µg/ml based on the literature on Hep G2 cells. In the combination treatment, only ½ is used, namely 4 µg/ml, then combined with the NC-Mosee treatment in graded doses starting from 15.75; 31.25; 62.5; 125; and 250 µg/ml. Then the IC50 dose was screened through the MTT test and proliferation test to determine the optimum incubation time for the treatment. After that, genomic measurements were carried out via RT-qPCR (calculation using Log 2 or relative gene expression) and proteomics via immunofluorescence. RT-qPCR measures Betatrophin, Wnt, β-catenin, CyclinD1, and Caspase-3, while Immunofluorescence measures Betatrophin only. Don't forget that, this research uses NC-Mosee whose physical properties have been confirmed through the Particle Size Analyzer test with a size of 125.8 nm. The use of chitosan is important in this research as a coating material for Moringa seed compounds. Considering that chitosan also provides strong electrostatic interactions with the negative charge of DNA to form nanoparticles effectively protects against nuclease degradation and helps cellular internalization of the compounds carried. Also obtained was a zeta potential value of 0.816 mV, which proved to be quite good with a positive value. Nanoparticles with positive zeta potential exhibit stable suspension properties, because the charge on the surface prevents particle aggregation. The compounds it contains have also been characterized via GC-MS and it was found that the dominance of compounds in the polar groups of flavonoids (1529.97 µg/g) and phenolics (187.37 µg/g), as well as non-polar including steroids (307.34 µg/g). ) and triterpenoids (254.16 µg/g). The IC50 dose of NC-Mosee was obtained at 498 μg/mL, while the combined IC50 dose was 262 μg/mL + Doxorubicin 4 μg/mL. The optimum time for the proliferation test is 48 hours. Through further genomic testing, it was proven that giving NC-Mosee treatment with new doses of 300, 400, & 500 μg/mL as well as giving combination therapy with NCMosee 262 μg/mL + Dox 4 μg/mL significantly decreased the Betatrophin marker. , Wnt, β- catenin, and CyclinD1, and increased in the apoptosis effector marker Caspase-3. This was also confirmed proteomically through the Immunofluorescence test that there was a decrease in cell viability as the dose increased, as indicated by the light intensity value. In this further test which used 6 types of treatment (CN, CP, 300, 400, 500 μg/mL, and 262 μg/mL + Doxorubicin 4 μg/mL) the value of each treatment was proven to be significant in the Tukey advanced test. The presence of NC-Mosee treatment increased the level of cytotoxicity in Hep G2 cancer cells compared to the negative control group. NC-Mosee causes changes in cell characteristic morphology leading to apoptosis in cancer cells. Likewise in the positive control and combination treatment through inhibition of topoisomerase II using Doxorubicin and NC-Mosee target performance. Caspase activity was seen to increase and was accompanied by a decrease in cell viability. As more DNA damage accumulates, the spheroid will lose its membrane integrity. This is supported by the results of checking via immunofluorescence or proteomics by targeting betatropin which is thought to play a role in cases of cancer proliferation. In other research, it was stated that the role of Betatropine in pancreatic cancer cells is to activate the WIF-1 pathway so that the proliferation signaling pathway via Wnt can be inhibited. In contrast, this study showed that Betatropin expression levels decreased as the dose of NC-Mosee increased. Therefore, the role of Betatropine in this proliferation signaling pathway needs to be studied further considering there is still a lack of literacy regarding this matter. Other literature states that Betatrophin can trigger HCC cell proliferation in vitro and in-vivo, and Betatrophin Knockout can inhibit the development of HCC in mice with HCC tumors. Furthermore, NC-Mosee was able to activate the main effector in the apoptosis process, namely caspase-3, as proven through RT-qPCR analysis of Caspase-3 expression. Considering that Caspase-3 plays an important role in activating enzymes in the protease pathway that induce apoptosis and are associated with cell death. This increase also occurred in the combination treatment. Where the use of this combination therapy is intended to minimize the use of generic drugs themselves. Remember that there are quite a lot of side effects from using this drug.

Item Type:	Thesis (Magister)
Identification Number:	0424060088
Divisions:	S2/S3 > Magister Ilmu Biomedis, Fakultas Kedokteran
Depositing User:	Unnamed user with username nova
Date Deposited:	04 Sep 2024 08:17
Last Modified:	04 Sep 2024 08:17
URI:	http://repository.ub.ac.id/id/eprint/229736

Text (DALAM MASA EMBARGO) MOCH SHOLEH.pdf Restricted to Registered users only Download (3MB)

Actions (login required)

View Item