Alang,, Hasria (2019) Studi Potensi Dan Gen Penyandi Bakteriosin Bakteri Asam Laktat Dari Susu Kerbau Belang (Bubalus Bubalis L.) Tana Toraja Sebagai Kandidat Probiotik. Doctor thesis, Universitas Brawijaya.
Abstract
Beberapa Bakteri Asam Laktat (BAL) dikatakan merupakan probiotik yang dapat memberikan dampak positif pada fisiologi dan kesehatan manusia ataupun hewan. Probiotik dimanfaatkan untuk mencegah dan mengobati penyakit infeksi serta menyeimbangkan mikroorganisme normal saluran pencernaan. Bakteri probiotik dapat memproduksi berbagai senyawa antimikroba yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme patogen. Senyawa antimikroba tersebut dapat digunakan untuk terapi terhadap bakteri patogen manusia guna mengurangi dampak resistensi terhadap antibiotika. Bakteri Asam Laktat umumnya banyak didapatkan dari susu Kambing Etawah, Sapi Bali maupun susu kerbau lumpur dan perah di Sumatera Utara. Namun penelitian tentang kandungan nutrisi susu dan diversitas BAL yang berasal dari susu Kerbau Belang/Tedong Bonga endemik Toraja (Bubalus bubalis Linn.) belum pernah dilaporkan. Oleh karena itu dilakukan eksplorasi BAL yang dapat digunakan sebagai probiotik. Tujuan penelitian ini adalah 1. menganalisis kandungan nutrisi dan keragaman BAL, 2. menganalisis potensi biomassa sel dan metabolit BAL terhadap bakteri patogen manusia, 3. mengidentifikasi spesies BAL kandidat probiotik, 4. optimasi produksi dan identifikasi bakteriosin yang dihasilkan BAL kandidat probiotik serta 5. identifikasi gen penyandi bakteriosin tersebut. Susu Kerbau Belang dari Kabupaten Tana Toraja dianalisis nutrisinya meliputi kandungan karbohidrat, protein, lemak, kadar abu, SNF, dan dianalisis keragaman BAL berdasarkan Indeks Simpson, kemudian diskrining sebagai kandidat probiotik meliputi uji hemolisa , ketahanan terhadap asam dan garam empedu, serta kemampuan menghasilkan senyawa antimikroba. Isolat BAL yang paling unggul selanjutnya diidentifikasi secara fenotipik dan filogenetik berdasarkan sekuen 16S rDNA. Produksi senyawa bakteriosin dioptimasi pada kondisi media pH awal 6, 7, dan 8 serta pada umur inkubasi 7,9, 11,13, 15, 17 dan 19 jam, senyawa bakteriosin yang dihasilkan selanjutnya dikarakterisasi kemudian dipurifikasi parsial dengan penambahan ammonium sulfat 40 %, 60 % dan 80 %. Gen penyandi bakteriosin isolat BAL kandidat probiotik tersebut diidentifikasi menggunakan primer spesifik yaitu EntA, EntB, EntP dan L50A/B. Bakteri Asam Laktat yang telah diisolasi dari susu Kerbau Belang Tana Toraja sebanyak empat belas isolat. Semua isolat BAL bersifat hemolisis atau tidak patogen pada mamalia. Semua isolat BAL dapat hidup pada pH 4 - 7, tetapi hanya empat isolat yaitu K1A, K2B1, K2B2, dan K4A2 yang mampu hidup pada pH 3. Isolat K2B1 dan K5B2 dapat hidup pada garam empedu (ox gall) 1 %. Cell free supernatant Netral (CFSN) isolat K1A, K2B1, dan K2B2 spesifik menghambat pertumbuhan Salmonella typhi sedangkan isolat K5B2 spesifik menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus. Cell free supernatant asam ( tanpa pengaturan pH) memiliki sifat antibakteri dengan spektrum yang lebih luas, isolat K1A dapat menghambat pertumbuhan EPEC; isolat K1B, K2B1, dan K2B2 dapat menghambat pertumbuhan EPEC dan Staphylococcus aureus, isolat iv K2C1, K2C2, K4A1, K4A2, dan K5A1 dapat menghambat pertumbuhan Salmonella typhi sedangkan K5B2 dapat menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus dan Salmonella typhi. Berdasarkan hasil tersebut, isolat K2B1 paling potensial sebagai kandidat probiotik. Sekuen 16S rDNA isolat BAL K2B1 merupakan kandidat probiotik memiliki similaritas 100 % dengan Enterococcus faecalis ATCC 19433. Senyawa Bakteriosin Like Inhibitory Substance (BLIS) Enterococcus faecalis K2B1 optimum diproduksi dalam media MRSB pada pH 8 umur inkubasi 13 jam. Senyawa BLIS tersebut tetap memiliki sifat antimikroba terhadap bakteri patogen setelah perlakuan pH 2, 3, 4, 8, 9, dan 10 serta pemanasan pada suhu 100 dan 121 C selama 15 menit, tetapi aktivitas antimikroba BLIS hilang setelah penambahan Proteinase K. Hasil tersebut menunjukkan bahwa senyawa BLIS yang dihasilkan oleh Enterococcus faecalis K2B1 adalah Bakteriosin. Bakteriosin isolat Enterococcus faecalis K2B1 memiliki aktivitas antibakteri tertinggi setelah dipurifikasi dengan ammonium sulfat konsentrasi 80 %. Semi pure bakteriosin tidak memiliki aktivitas antibakteri setelah direaksikan dengan Proteinase K. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa semi pure bakteriosin diduga merupakan Enterocin. Senyawa enterocin tersebut pada overlaid gel SDS-PAGE memiliki berat molekul sekitar lima kilo Dalton. Gen penyandi Enterocin Enterococcus faecalis K2B1 dapat diamplifikasi menggunakan primer universal LB 50A/B dengan ukuran sekuen 86 bp. Sekuen gen penyandi enterocin pada Enterococcus faecalis K2B1 memiliki similaritas 94 % dengan Hypothetical protein yang merupakan protein prebakteriosin atau prekursor bakteriosin. Hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa isolat Enterococcus faecalis K2B1 dapat dikembangkan sebagai produk probiotik. Isolat BAL tersebut memenuhi syarat sebagai probiotik antara lain bersifat non patogen, resisten pada pH rendah (pH3) dan garam empedu 1 % serta mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen manusia yaitu EPEC, S. aureus dan S. typhi.
English Abstract
Lactic Acid Bacteria (LAB) as probiotics, its have positive impact on the physiology and healthy of humans or animals. Probiotics was used to prevent and treat infectious diseases and balance normal microorganisms digestive tract. Probiotic bacteria can produce various antimicrobial compounds that inhibit the growth of pathogenic microorganisms. Antimicrobial compounds can be used for therapy against human pathogenic bacteria to reduce the impact of resistance to antibiotics. Lactic Acid Bacteria are commonly obtained from Etawah Goat milk, Bali Cattle and mud and buffalo milk in North Sumatera. However, research on milk nutrient content and diversity of LAB from Belang buffalo milk/Tedong Bonga endemic from Toraja (Bubalus bubalis Linn.) has never been reported. Therefore it is necessary to explore LAB which can be used as a probiotic. The purpose of this study was to 1. analyze the nutritional content and diversity of BAL, 2. analyze the potency of cell biomass and LAB metabolites against human pathogenic bacteria, 3. identify species of probiotic LAB candidates, 4. optimize production and identify of bacteriocins produced by probiotic LAB candidates, 5. identify the bacteriocin encoding gene. Belang Buffalo milk from Tana Toraja Regency was tested for its nutritional content including carbohydrate, protein, fat, ash content, SNF, and analysis of the diversity of LAB based on the Simpson Index. Lactic Acid Bacteria as probiotics candidates are screened based on hemolysis tests, acid and bile salts resistance, and ability to produce antimicrobial compounds. Lactic acid bacteria isolates of probiotic candidates were identified phenotypically and phylogenetically using 16S rDNA sequences. The production of bacteriocin compounds was optimized under conditions of pH 6, 7, and 8 and at incubation ages 7,9,11,13, 15, 17 and 19 hours. Bacteriocin compounds was characterized after purification with ammonium sulfate 40%, 60% and 80%. The bacteriocin encoding gene isolate BAL of the probiotic candidate was identified using a specific primer. Lactic acid bacteria isolated from Belang Tana Toraja buffalo milk were fourteen isolates. All LAB isolates are hemolysis or not pathogenic in mammals. All LAB isolates can survive at pH 4 - 7, but only four isolates K1A, K2B1, K2B2, and K4A2 are able to survive at pH 3. Isolate K2B1 and K5B2 can survive in bile salts (ox gall) 1%. Neutral cell free supernatant (CFSN) of K1A, K2B1, and K2B2 specific inhibited the growth of Salmonella typhi while K5B2 isolates inhibited the growth of Staphylococcus aureus. Acid free cell supernatants have broader antibacterial spectrum, K1A isolates inhibit EPEC growth; K1B, K2B1, and K2B2 isolates inhibit EPEC growth and Staphylococcus aureus, K2C1, K2C2, K4A1, K4A2, and K5A1 isolates inhibit Salmonella typhi growth while K5B2 can inhibit the growth of Staphylococcus aureus and Salmonella typhi. The results show that K2B1 isolate was the most potential as probiotic candidates. Isolate K2B1 as probiotic candidate has 100 % similarity with Enterococcus faecalis ATCC 19433. The vi optimum Bacteriocin Like Inhibitory Substance (BLIS) Enterococcus faecalis K2B1 compound is produced in MRSB media at pH 8 and incubation 13 hours. The BLIS compounds still have antimicrobial properties against pathogenic bacteria after pH 2, 3, 4, 8, 9, and 10 treatments and heating at temperatures of 100 °C and 121 °C for 15 minutes; but the antimicrobial activity was lost after treated by Proteinase K. The results showed that the BLIS compound produced by Enterococcus faecalis K2B1 was Bacteriocin. Bacteriocin of Enterococcus faecalis K2B1 had the highest antibacterial activity after purification with 80 % ammonium sulfate concentration. Semi pure bacteriocin have not antibacterial activity after treated by Proteinase K. This shows that the semi pure bacteriocin is Enterocin. The semi pure Enterocin in SDS-PAGE gel overlaid has a molecular weight 5 kDa. The Enterocin encoding gene can be amplified using primer LB 50A / B with 86 bp sequence size. The sequence of enterocin encoding genes in Enterococcus faecalis K2B1 has a 94 % similarity with Hypothetical protein as a bacteriocin precursor. The results of this study can be concluded that the Enterococcus faecalis K2B1 isolate can be developed as a probiotic product. The LAB isolate qualifies as probiotics, among criteria such as non-pathogenic, resistant to low pH (pH 3) nd 1 % bile salt and can inhibit the growth of human pathogenic bacteria, namely EPEC, S. aureus and S. typhi
Other obstract
-
| Item Type: | Thesis (Doctor) |
|---|---|
| Identification Number: | DIS/479.35/ALA/s/2019/061903347 |
| Uncontrolled Keywords: | LACTIC ACID BACTERIA |
| Subjects: | 500 Natural sciences and mathematics > 579 Natural history of microorganisms, fungi, algae > 579.3 Prokaryotes > 579.35 Gram-positive cocci |
| Divisions: | S2/S3 > Doktor Biologi, Fakultas MIPA |
| Depositing User: | Endang Susworini |
| Date Deposited: | 07 Feb 2022 05:41 |
| Last Modified: | 07 Feb 2022 05:41 |
| URI: | http://repository.ub.ac.id/id/eprint/189440 |
Preview |
Text
HASRIA ALANG.pdf Download (13MB) | Preview |
Actions (login required)
 |
View Item |