Fitri, Loeki Enggar (2004) Analisis Patogenesis Malaria Dengan Kompeikasi : Tinjauan Molekuler Terhadap Peran Molekul Adhesi Eritrosit Terinfeksi Plasmodium Falciparum Isolat Malang Dan Keterlibatan Senyawa Oksigen Reaktif. Doktor thesis, Universitas Brawijaya.
Abstract
Ada dua proses patologis yang mendasari terjadinya komplikasi pada infeksi malaria yaitu aktivasi endotel secara sistemik akibat cytoadherence eritrosit terinfeksi Plasmodium falciparum (P.falciparum) pada mikrovaskuler dan tingginya produksi Tumour Necrosis Factor-a (TNF-a) serta molekul radikal yang dapat menyebabkan anoksia dan kerusakan jaringan. Masih sedik' it sekali penelitiari yang mengkaji pengaruh dari proses cytoadherence baik secara in vivo maupun in vitro dan keterlibatan senyawa oksigen reaktif dalam patogenesis terjadinya komplikasi pada infeksi malaria falciparum. Proses cytoadherence merupakan interaksi molekuler yang melibatkan Plasmodium falciparum Erythrocyte Membran Protein (PfEMP-1) pada membran eritrosit terinfeksi P. falciparum sebagai ligand utama dengan Intercelluler Adhesion Molecule-1 (ICAM-1) sebagai reseptor terbesar pada membran sel endotel. PfEMP-1 merupakan antigen yang bersifat strain specific. Di Indonesia belum pernah dilakukan penelitian tentang molekul adhesi eritrosit terinfeksi P. falcipamm dan hubungan molekul tersebut dengan patogenesis terjadinya komplikasi pada infeksi malaria . Tujuan dari penelitian ini adalah mengkaji karakteristik dan peran molekul adhesi eritrosit terinfeksi P. falcipamm serta keterlibatan senyawa oksigen reaktif dalam patogenesis terjadinya komplikasi pada infeksi malaria di Malang. Untuk mencapai tujuan tersebut dilakukan 3 tahap penelitian. Tahap pertama adalah suatu penelitian cross sectional. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui perbedaan persentase cytoadherence, kadar Nitric Oxide (NO) dan Hidrogen Peroksida (H202) plasma antara penderita malaria tanpa komplikasi dengan penderita malaria yang mengalami komplikasi selama infeksi P. falcipamm isolat Malang. Sampel darah diambil secara quota. Cytoadherence assay dilakukan in vitro menggunakan biakan sel endotel (HUVECs) sebagai model dan biakan darah penderita malaria . Kadar NO ditentukan melalui pengukuran Nitrit suatu produk degenerasi NO yang stabil menggunakan metode Colorimetric non enzimatik (Oxford Biomedical Research). Kadar H202 ditentukan dengan metode Colorimetric menggunakan kit Amplex Red Hydrogen Peroxide (Molecular Probe). In vivo, dari 30 sampel penelitian yang terdiri dari 15 penderita malaria falcipamm dengan komplikasi dan 15 penderita malaria falcipamm tanpa komplikasi didapatkan rata rata persentase cytoadherence penderita malaria dengan komplikasi lebih tinggi secara signifikan daripada penderita malaria tanpa komplikasi (p= 0,001). Rata rata kadar H202 plasma penderita malaria falcipamm dengan komplikasi adalah sebesar 2,98 uM dan rata rata kadar H202 plasma penderita malaria falcipamm tanpa komplikasi adalah sebesar 0,46 uM. Dengan uji t didapatkan perbedaan yang signifikan ( p= 0,000). Diluar dugaan, kadar NO plasma penderita malaria dengan komplikasi lebih rendah daripada kadar NO plasma penderita malaria tanpa komplikasi. Rata rata kadar NO plasma penderita x malaria dengan komplikasi adalah sebesar 55,55 uM dan rata rata kadar NO plasma penderita malaria tanpa komplikasi adalah sebesar 113,56 uM. Dengan uji tterdapat perbedaan yang signifikan (p=0,000). Tahap kedua adalah penelitian eksploratif untuk isolasi dan karakterisasi molekul adhesi pada membran eritrosit terinfeksi P. falciparum dan membran sel endotel. Untuk mencapai tujuan tersebut dilakukan langkah langkah sebagai berikut: (i) Isolasi protein adhesi eritrosit terinfeksi P. falciparum dan sel endotel (HUVECs) menggunakan NOG 0,5% dan purifikasi protein adhesi menggunakan metode electroelution (ii) Karakterisasi protein adhesi eritrosit terinfeksi P. falciparum menggunakan elektroforesis SDS-PAGE dan elektroforesis dua dimensi (IEF-SDSPAGE) (iii) ) Uji hambat molekul adhesi secara in vitro (iv) Pembuatan antibodi terhadap molekul adhesi dan evaluasi spesifisitas antibodi terhadap molekul adhesi menggunakan metode imunositokimia dan Western Blot. Isolasi dengan NOG 0,5% pada sel endotel yang teraktivasi dengan TNF-u. dosis 16 pg/ml dan 32 pg/ml akan memunculkan pita protein dengan perkiraan berat molekul 93,63 kDa.(~94 kDa) , pita protein ini diperkirakan adalah protein reseptor CD 54 atau ICAM-1 karena secara teoritis berat molekul protein ini berkisar antara 88-100 kDa. Isolasi NOG ke I pada eritrosit terinfeksi P.falcipamm yang mengadakan adhesi pada sel endotel, memunculkan pita protein dengan berat molekul 271,52 kDa (~270 kDa) dan 94 kDa. Protein 270 kDa ini diprediksi sebagai molekul adhesi eritrosit terinfeksi malaria falciparum pada sel endotel yaitu PfEMP-1, karena secara teoritis eritrosit normal tidak mempunyai protein dengan berat molekul di atas 250 kDa, dan berat molekul Pf EMP-1 adalah berkisar antara 260- 300 kD, selain Hu protein ini dapat melakukan hambat adhesi secara langsung. Gambaran protein melalui elektroforesis dua dimensi menunjukkan protein yang cenderung bersifat basa. Tahap ketiga adalah penelHian eksperimental laboratorium.Tujuan penelHian tahap ini adalah (i) Untuk mengetahui apakah pemaparan TNF-a dapat meningkatkan ekspresi ICAM-1 dan kemampuan cytoadherence eritrosH terinfeksi P. falciparum isolat Malang pada sel endotel (HUVECs) in vitro, (ii) Untuk mengetahui apakah pemaparan TNF-a dan eritrosH terinfeksi P. falciparum dapat meningkatkan ekspresi Inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) dan produksi Reactive Oxigen Intermediate (ROI) pada sel endotel (HUVECs) in vitro. Pada tahap ini, sel endotel diinduksi dengan TNF-a dosis 4 pg/ml, 8pg/ml, 16pg/ml dan 32 pg/ml selama 20 jam dan diberi eritrosH terinfeksi P.falciparum selama 1 jam. Ekspresi ICAM-1dan iNOS dilihat melalui teknik imunositokimia menggunakan antibodi monoklonal terhadap ICAM-1 (Dako) dan antibodi monoklonal terhadap iNOS (InnoGenex). Produksi ROI dilihat secara semikwantitatif menggunakan NBT-Reduction assay. Untuk melihat proses kematian sel yang terjadi pada sel endotel dilakukan pengamatan morfologis dan pemulasan imunositokimia menggunakan antibodi terhadap Caspase 3 (Santa Cruz). Ekspresi ICAM-1 telah tampak pada sel endotel normal dan pada sel endotel yang dipapar dengan eritrosit terinfeksi P.falcipamm, ekspresi ini meningkat setelah sel endotel diinduksi TNF-a. Pengamatan imunos' Hokimia menunjukkan hubungan yang signifikan antara intensitas dan persentase sel yang mengekspresikan ICAM-1 dengan penambahan dosis TNF-a. Pada dosis 32 pg/ml ekspresi ICAM-1 sangat nyata (++++), memenuhi seluruh membran sel dan ditemukan pada hampir seluruh sel, beberapa sel mengalami tanda tanda apoptosis. Dengan uji Anova didapatkan perbedaan persentase cytoadherence yang bermakna antara kelima dosis TNF-a di atas (p = 0,000) dan pada uji Tukey terlihat bahwa perbedaan bermakna terjadi antara xi kelompok kontrol dengan kelompok yang dipapar dengan TNF-a dosis 16 pg/ml ( p=0,004) dan 32pg/ml (p= 0,000). Pada analisis Pearson didapatkan korelasi positif yang sangat bermakna (r= 0,929). Ekspresi iNOS hanya di dapatkan pada sel endotel yang diberi eritrosit terinfeksi P.falciparum saja atau yang diberi kombinasi TNF-a berbagai dosis dan eritrosit terinfeksi P.falciparum . Intensitas ekspresi ini berkisar dari yang rendah sampai sedang (+ to +++). Dengan uji Anova didapatkan p = 0,000 dan pada uji Tukey teriihat perbedaan yang signifikan terjadi antara kelompok kontrol yaitu yang hanya diberi eritrosit terinfeksi P.falciparum saja dengan semua kelompok yang dipapar dengan TNF-a berbagai dosis dan eritrosit terinfeksi P.falciparum (p = 0,000). Dari pengamatan secara imunositokimia, teriihat bahwa produksi ROI dapat dideteksi pada sel endotel yang diinduksi dengan PMA. Pada sel endotel yang diinduksi dengan TNF-a dan eritrosit terinfeksi P.falciparum produksi ini semakin meningkat (++ sampai ++++) sesuai peningkatan dosis TNF- a . Dengan uji Anova, didapatkan perbedaan yang signifikan (p = 0,000). Pada uji Tukey teriihat perbedaan yang signifikan terjadi antara kelompok kontrol dengan kelompok yang dipapar dengan TNF-a dosis 8 pg/ml ( p =0,000) dosis 16 pg/ml ( p=0,000) dan dosis 32pg/ml (p= 0,000). Pelepasan ROI yang diinduksi oleh TNF-a sebenarnya merupakan respon imunologis terhadap parasit, tetapi temyata juga memberikan dampak pada sel itu sendiri dan sel sekitamya. Pada sediaan tampak beberapa sel mengecil (shringkage) dengan membran sel mengalami pengkerutanIblebbing disertai kondensasi kromatin pada nukleusnya. Dengan pemulasan imunositokimia ekspresi caspase 3 tampak pada sitoplasma dari sel endotel terutama pada pemberian eritrosit terinfeksi P. falciparum bersama sama TNF-a dosis 32 pg/ml. Cytoadherence eritrosit terinfeksi P. falciparum pada sel endotel merupakan faktor penting dalam patofisiologi infeksi malaria. Proses ini diduga berhubungan dengan aktivasi sel endotel dan pengeluaran senyawa oksigen reaktif yang dapat menyebabkan kerusakan jaringan. Kadar NO plasma yang rendah pada penderita malaria dengan komplikasi dimungkinkan karena konversi pembentukan senyawa oksigen reaktif bentuk lain. Adhesi eritrosit terinfeksi P. falciparum juga dapat menginduksi produksi ROI in vitro maupun in vivo. Proses cytoadherence eritrosit terinfeksi P. falciparum isolat Malang diperantarai oleh suatu molekul dengan BM 270 kDa. Molekul ini dapat menginduksi respon humoral dan dapat menyebabkan penghambatan secara langsung secara kompetitif pada proses cytoadherence in vitro. Diduga protein tersebut adalah PfEMP-1. Penelitian ini diharapkan mampu menghasilkan model penelitian untuk lebih memahami patogenesis terjadinya komplikasi pada infeksi malaria yang disebabkan oleh P. falcipamm pada tingkat molekuler. Disamping teori terjadinya anoksia, didapatkan suatu konsep imunologis lokal yang berperan penting dalam terjadinya komplikasi pada malaria berat. Beberapa molekul teriibat dalam proses apoptosis yang terjadi diantaranya TNF-a,NO dan radikal bebas lainnya. Dari segi praktis keberhasilan identifikasi protein spesifik berupa molekul adhesi eritrosit terinfeksi Plasmodium falciparum isolat Malang yang berperan dalam proses patologi malaria berat diharapkan bermanfaat sebagai bahan pertimbangan dalam pemahaman yang lebih mendalam tentang patogenesis serta perencanaan usaha pencegahan komplikasi pada infeksi malaria berat.
English Abstract
There are two major pathophysiological processes occur in severe malaria including cytoadherence of parasitized erythrocytes to vascular endothelium and release aberrant Tumour Necrosis Factor-a (TNF-a) and radicals molecules which may cause anoxia and organs damage. Only a few study had been done on the effect of cytoadherence in vivo and in vitro and reactive oxygen species activity on the pathogenesis of complicated malaria Cytoadherence is molecular interaction process mediated by Plasmodium falciparum Erythrocyte Membrane Protein (PfEMP-1) as specific ligand in erythrocytes membrane and Intercellular Adhesion Molecule -1 (ICAM-1) as a major receptor in endothelial cells membrane. PfEMP-1 is strain specific. No research have been done about adhesion molecule on P. falciparum infected erythrocytes and its relation to pathogenesis of complicated malaria in Indonesia. The aim of this research is to characterize and analyze the role of Plasmodium falcipamm Infected Erythrocytes adhesion molecule and reactive oxygen species activity on pathogenesis of complicated malaria in Malang. For that purpose, this research were done in 3 steps. The first study in this research was a cross sectional study, to see the difference of cytoadherent percentage ,the plasma level of Nitric Oxide (NO) and Hydrogen Peroxide (H202) between uncomplicated and complicated malaria in Malang sub district. Blood samples of 30 patients with acute falcipamm malaria were obtained by quota sampling. Cytoadherence assay were done in vitro using endothelial cells culture (HUVECs) as a model . The level of Nitric Oxide (NO) was determined indirectly by measuring the accumulation of its stable degradation products nitrite with Colorimetric non-enzymatic assay for NO (Oxford Biomedical Research). The level of plasma Hydrogen Peroxide (H202) were determined by calorimetric method using Amplex Red Hydrogen Peroxide kit (Molecular Probe). The mean values for cytoadherent percentage of complicated malarial patients were significantly higher than of uncomplicated malaria patients ( p= 0,001).The mean plasma level of H202 of complicated and uncomplicated malaria patients were 2,98 uM and 0,46 uM respectively. Using t test there was a significant difference ( p= 0,000). On the other hand the level of NO on plasma patients with complicated malaria were significantly lower than uncomplicated patients ( 55,55 uM and 113,56 uM respectively, p= 0,000). An explorative method had been done in the second study of this research to isolate and characterize adhesion molecule of parasitized erythrocyte and its receptor on endothelial cells . For this purpose 4 steps had been done : (i) Isolation of P.falcipamm infected erythrocytes and endothelial cells membrane adhesion molecule by 0,5% NOG and purification of the protein by electroelution (ii) (iv) Inhibition test using xiii in vitro competitive assay (iii) Characterization of P.falciparum infected erythrocytes membrane adhesion molecule by SDS PAGE eiectroforesis and two dimension electroforesis (IEF-SDSPAGE) (iv) Antibody induction and specificity test for humoral response by immunocytochemistry and Western Blot. Isolation protein membrane of endothelial cells activated by TNF-a dose 16 pg/ml and 32 pg/ml with NOG 0,5% produced specific band with molecular weight 93,63 kDa (~94 kDa). It was suggested as CD 54 protein or ICAM-1, because this receptor has molecular weight 88 to100 kDa. NOG Iisolation of P.falcipamm infected erythrocytes which adherent to endothelial cells identified two specific bands with molecular weight 271,52 kDa (~270 kDa) and 94 kDa . The first protein was suggested as PfEMP-1 because normal erythrocyte does not have protein with molecular weight above 250 kDa, and molecular weight of Pf EMP-1 is 260- 300 kDa. The protein also showed to inhibit cytoadherence in vitro and due to a basic protein. The last study in this research was an experimental laboratory study. The objective of this step is to see (i) the effect of TNF-a induction in increasing intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) expression, and cytoadherent percentage on endothelial cells culture (HUVECs) . (ii) the effect of P.falciparum infected erythrocytes adhesion and TNF-a induction in increasing Inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) expression and Reactive Oxygen Intermediate (ROI) production on endothelial cell culture (HUVECs) in vitro. In this study endothelial activation was observed after has been exposed 20 hours with TNF-a dose 4 pg/ml, 8pg/ml, 16pg/ml and 32 pg/ml and 1 hour with P.falciparum infected erythrocytes. Expression of ICAM-1 and iNOS had been detected by immunocytochemistry staining by using ICAM-1 monoclonal antibody (Dako) and iNOS monoclonal antibody (InnoGenex ). ROI production was determined semi quantitatively by using NBT Reduction-assay. ICAM-1 expression was found in normal and treated endothelial cell culture either by P.falciparum infected erythrocytes or TNF-a. Quantification showed a significant association between the intensity and the percentage of ICAM-1 expression in the cells with the increasing dose of TNF-a. On dose 32 pg/ml ICAM-1 expression was very strong (++++), found in all part of cells membrane of endothelial cells and related to histopathological changes like apoptosis. Using Anova test, there was a significant difference of cytoadherent percentage among cells which treated with different dose of TNF-a (p = O,000).Using Tukey test, there was a significant difference between control cells and cells which were treated with TNF-a dose 16 pg/ml ( p=0,004) and 32pg/ml(p= 0,000). Pearson analyze showed a positive correlation (r= 0,929). iNOS expression only found on endothelial cells culture treated with P.falciparum infected erythrocytes or both P.falciparum infected erythrocytes and TNF-a. The intensity of the this expression range from low to medium (+ to +++). Using Anova test, there was also a significant difference in iNOS expression among cells which were treated with different dose of TNF-a and (p= 0,000) and using Tukey test, there was a significant difference between control cells which only treated with P.falciparum infected erythrocytes and all cells which were treated with different dose of TNF-a and P.falciparum infected erythrocytes (p= 0,000). The normal endothelial cells release low level of ROI in the presence of nonspecific trigger, PMA. In the presence of P.falciparum infected erythrocytes and TNF-a some ceils showed medium to high levels of ROI (++ to ++++) depend on the dose of TNF-a There was a significant difference in ROI expression among cells which were treated with P.faldpanjm infected erythrocytes and different dose of TNF-a (p = 0,000) and using Tukey test, there was a significant difference between control cells and cells * xiv which were treated with TNF-rt dose 8 pg/ml (p= 0,000), 16 pg/ml ( p=0,000) and 32pg/ml (p= 0,000). Although release of ROI was an immunological response to parasite, it can cause apoptosis of the cells. Some cells showed shringkage phenomena with membrane blebbing. There was condensation of chromatin in nucleus of the cells. Using immunocytochemistry some cells expressed caspase 3 in their cytoplasma especially on endothelial cells which were exposed withP. falciparum and TNF-a dose 32 pg/ml . Cytoadherence of P. falciparum infected erythrocytes on endothelial cells is a key factor in development of severe malaria. This process is significantly associated with the activation of local immun on endothelial cells and release of reactive oxygen species which cause cells damage. A low level of NO in the plasma severe malaria patient may be due to product conversion to another form of reactive oxygen species . Cytoadherence of P. falciparum infected erythrocytes on endothelial cells also induced the production of Reactive Oxygen Intermediate (ROI) in vitro and in vivo, that cause cells damage like apoptosis. Cytoadherence of P. falciparum infected erythrocytes on endothelial cells is mediated by adhesion molecule, a protein with molecular weight 270 kDa on membrane of P. falciparum infected erythrocytes. This protein that induce specific antibody and showed to inhibit cytoadherence in vitro might be PfEMP-1. This research provide a study model to examine the pathophysiology of complicated malaria in molecular aspect. Immun local concept might be important factor beyond parasite sequestration in mediating endothelial cells damage in severe malaria. There are a number molecules by which pathological stimuli lead to apoptosis of the cells including TNF-a, NO and other free radical. In application identification of specific adhesion protein of Plasmodium falciparum Malang isolate could be useful for diagnostic development, preventive tool and prognosis marker of severe malaria.
| Item Type: | Thesis (Doktor) |
|---|---|
| Identification Number: | - |
| Divisions: | S2/S3 > Doktor Ilmu Kedokteran, Fakultas Kedokteran |
| Depositing User: | soegeng sugeng |
| Date Deposited: | 31 Jul 2024 02:26 |
| Last Modified: | 31 Jul 2024 02:26 |
| URI: | http://repository.ub.ac.id/id/eprint/225965 |
![[thumbnail of LOEKI ENGGAR FITRI.pdf]](http://repository.ub.ac.id/style/images/fileicons/text.png) |
Text
LOEKI ENGGAR FITRI.pdf Download (7MB) |
Actions (login required)
 |
View Item |