Rahmadani, Nabila and Dr. rer.nat. Dra. Tri Yudani M. R, M.App.Sc and Dr. dr. Maimun Zulhaidah Arthamin, M.Kes, SpPK(K) (2023) Uji Imunogenitas Humoral In Vivo Dan In Silico Antigen Protein Rekombinan Ag38 kDa Mycobacterium tuberculosis. Magister thesis, Universitas Brawijaya.
Abstract
Diagnosis tuberkulosis (TB) di Indonesia merupakan tantangan bagi petugas kesehatan, karena bersifat non spesifik dan memiliki banyak keterbatasan pada tes diagnostik yang sudah ada. TB adalah penyakit menular yang disebabkan oleh bakteri Mycobacterium tuberculosis (Mtb) yang biasanya menyerang paru-paru (TB paru) tetapi juga dapat menginfeksi organ lain. Salah satu protein imunogenik dari Mtb adalah Ag38. Ag38-rekombinan dari strain lokal sebelumnya telah dikembangkan di Laboratorium Biokimia-Biologi Molekuler Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. Protein ini merupakan subunit pengikat fosfat dari transporter M. tuberculosis. Protein Ag-38 atau disebut juga PstS1 terbukti mampu memicu munculnya antibodi IgG dan IgA, keduanya dapat mengenali kompleks epitope dari Ag38-rek. Penelitian dilakukan 2 tahap, pertama yaitu in vivo yang bertujuan untuk mengetahui imunogenitas protein Ag38-rek dalam menstimulasi produksi antibodi khususnya imunoglobulin G pada mencit Balb/C serta menentukan konsentrasi mana yang dapat menstimulasi produksi antibodi tertinggi. Tahap ke dua adalah in silico yang bertujuan untuk membandingkan bagaimana ikatan docking dari IgG dan IgA terhadap protein Ag38. Metode penelitian tahap I adalah “True Experimental Design” dengan design “The post test-only control group”. Sampel terdiri dari 1 kelompok dengan total 10 mencit sehat yang diinduksi protein Ag38-rek sebagai perlakuan selama 4 minggu. Pada minggu pertama mencit diinduksi dengan konsentrasi 25 μg/100 μl, kemudian konsentrasi ditingkatkan pada booster 1, 2, dan 3 menjadi 50 μg/100 μl. Kemudian darah mencit diaspirasi untuk diuji konsentrasi IgG menggunakan ELISA. Pada uji Anova one way, diperoleh hasil bahwa tidak terjadi perbedaan signifikan pada konsentrasi IgG tiap kelompok (p=0,296), Namun hasil induksi booster ke 3 menghasilkan konsentrasi antibodi humoral IgG tertinggi yaitu 1,404 mg/ml. Penelitian tahap II adalah in silico bioinformatika molecular docking. Sampel yang digunakan adalah protein Ag38 yang diambil dari Mycobrowser, IgG serta IgA yang diambil dari PDB dan NCBI. Sampel kemudian di potong ligan menggunakan Yasara dan divisualisasikan dengan Chimera 1.17.1. Protein Ag38 kemudian dilakukan prediksi epitope menggunakan IEDB. Penambatan ligan protein menggunakan HDOCK dan analisis konformasi ikatan protein menggunakan program PDBSum. Analisis hasilnya adalah Ag38 memiliki sensitivitas pengikatan lebih tinggi kepada IgG daripada IgA. Docking pada model 2 protein Ag38 dengan IgG memiliki nilai docking score -229.70, confident score 0.8312 dan RMSD 1.060. Kemudian juga pada analisis plot Ramachandran model pengikatan Ag38 dengan IgG memiliki nilai disallowed regions adalah kurang dari 0,8%, yaitu 0,5%. Pada evaluasi most favoured regions didapatkan hasil sebesar 90.5% dengan G-factor -0.27. Evauasi ini menunjukkan bahwa kualitas struktur model 3D penambatan Ag38 dengan IgG dapat dikatakan baik karena memenuhi syarat-syarat struktur ideal, yaitu memiliki sebaran residu lebih dari 90% di daerah the most favoured regions, memiliki sedikit residu di daerah disallowed regions dan memiliki nilai keseluruhan G-Factors di atas -0,5. Evaluasi ini menunjukkan bahwa antigen Ag38 memiliki spesifitas ikatan lebih tinggi pada IgG dibandingkan IgA. Dapat disimpulkan bahwa protein Ag38 merupakan protein imunogenik yang dapat menginduksi produksi antibodi khusunya IgG pada mencit Balb/C, yaitu pada induksi booster ke 3 dengan konsentrasi 50 μg/100 μl yang menghasilkan konsentrasi IgG tertinggi yaitu 1,404 mg/ml. Secara in silico, protein Ag38 lebih imunogenik pada IgG dibandingkan IgA, yang menunjukkan Ag38 memiliki spesifitas dan sensitivitas lebih tiggi pada IgG. Diharapkan hasil ini dapat digunakan sebagai dasar pembuatan serodiagnostik kit untuk menegakkan diagnosis tuberkulosis.
English Abstract
TB diagnosis in Indonesia is a challenge for health workers, because it is non-specific and has many limitations in existing diagnostic tests. TB is an infectious disease caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis (Mtb) which usually attacks the lungs (pulmonary TB) but can also infect other organs. One of the immunogenic proteins from Mtb is Ag38. Recombinant Ag38 from a local strain was previously developed at the Biochemistry-Molecular Biology Laboratory, Faculty of Medicine, Brawijaya University. This protein is a phosphate-binding subunit of the M. tuberculosis transporter. The Ag-38 protein or also called PstS1 has been proven to be able to trigger the emergence of IgG and IgA antibodies, both of which can recognize the epitope complex of Ag38-rek. The research was carried out in two stages, the first was in vivo which aimed to determine the immunogenicity of the Ag38-rek protein in stimulating antibody production, especially immunoglobulin G in Balb/C mice and to determine which concentration could stimulate the highest antibody production. The second stage is in silico which aims to compare how the docking of IgG and IgA binds to the Ag38 protein. The first research method is "True Experimental Design" with the design "The post test-only control group". The sample consisted of 1 group with a total of 10 healthy mice induced by Ag38-rek protein as a treatment for 4 weeks. In the first week the mice were induced with a concentration of 25 μg/100 μl, then the concentration was increased in boosters 1, 2, and 3 to 50 μg/100 μl. Then the mice's blood was aspirated to test the IgG concentration using ELISA. In the one-way ANOVA test, the results showed that there was no significant difference in IgG concentrations for each group (p=0,296). However, the results of the 3rd booster induction produced the highest IgG humoral antibody concentration, namely 1.404 mg/ml. Second research is in silico bioinformatics molecular docking. The samples used were Ag38 protein taken from Mycobrowser, IgG and IgA taken from PDB and NCBI. The sample was then cut off with the ligand using Yasara and visualized with Chimera 1.17.1. The Ag38 protein was then predicted for the epitope using IEDB. Protein ligand fixation using HDOCK and protein binding conformation analysis using PDBSum program. Analysis of the results showed that Ag38 has a higher binding sensitivity to IgG than IgA. Docking in model 2 of the Ag38 protein with IgG has a docking score of -229.70, a confident score of 0.8312 and RMSD 1.060. Then also in the analysis of the Ramachandran plot the Ag38 binding model with IgG has disallowed regions values of less than 0.8%, namely 0.5%. In the evaluation of the most favored regions, the results were 90.5% with a G-factor of -0.27. This evaluation shows that the structural quality of the 3D model for binding Ag38 with IgG can be said to be good because it fulfills the ideal structure requirements, namely having a residue distribution of more than 90% in the most favored regions, having few residues in the disallowed regions and having an overall value of G -Factors above -0.5. This evaluation shows that the Ag38 antigen has a higher binding specificity to IgG than IgA. It can be concluded that the Ag38 protein is an immunogenic protein that can induce the production of humoral antibodies, especially IgG in Balb/C mice, namely in the 3rd booster induction with a concentration of 50 μg/100 μl which produced the highest IgG concentration of 1.404 mg/ml. In silico, Ag38 protein is more immunogenic on IgG than IgA, which shows Ag38 has higher specificity and sensitivity on IgG. It is hoped that these results can be used as a basis for making a kit serodiagnostic agent to detect tuberculosis.
| Item Type: | Thesis (Magister) |
|---|---|
| Identification Number: | 042306 |
| Divisions: | S2/S3 > Magister Ilmu Biomedis, Fakultas Kedokteran |
| Depositing User: | Endang Susworini |
| Date Deposited: | 29 Jan 2024 03:10 |
| Last Modified: | 29 Jan 2024 03:10 |
| URI: | http://repository.ub.ac.id/id/eprint/214436 |
![[thumbnail of DALAM MASA EMBARGO]](http://repository.ub.ac.id/style/images/fileicons/text.png) |
Text (DALAM MASA EMBARGO)
Nabila Rahmadani.pdf Restricted to Registered users only Download (3MB) |
Actions (login required)
 |
View Item |