Transformasi Plasmid Rekombinan pPIC9K-Kex2 ke dalam Sel lllYeast Pichia pastoris Galur GS115 dengan Metode Elektroporasi

Fadriana Dewi, Vina and Feronika Heppy Sriherfyna,, STP., MP., Ph.D and Neng Herawati,, S.Si., M.Si (2023) Transformasi Plasmid Rekombinan pPIC9K-Kex2 ke dalam Sel lllYeast Pichia pastoris Galur GS115 dengan Metode Elektroporasi. Sarjana thesis, Universitas Brawijaya.

Abstract

RINGKASAN Insulin glargine adalah salah satu analog insulin yang dirancang supaya lebih cepat diserap oleh tubuh dan bekerja bersamaan dengan insulin alami. Insulin glargine diproduksi melalui rekayasa genetika dan transformasi genetik. Sel inang yang digunakan untuk memproduksi insulin ini adalah Pichia pastoris. Pichia pastoris merupakan yeast yang sering dimanfaatkan sebagai sel inang transformasi genetik untuk keperluan ekspresi protein rekombinan. Pada produksi protein insulin glargine, Kex2 protease berperan penting dalam pematangan proteinnya. Pratiwi et al. pada tahun 2022 mengungkapkan bahwa gen Kex2 berperan untuk meningkatkan tingkat sekresi protein dan memproses preproprotein menjadi protein matang. Akan tetapi, Kex2 protease yang dihasilkan secara alami oleh Pichia pastoris tidak cukup mematangkan protein insulin glargine. Hal ini menyebabkan adanya proses tambahan berupa adanya treatment tripsin untuk mematangkan prekursor insulin menjadi dua rantai yang menghasilkan pengotor berupa residu lisin dan arginin, serta menambah biaya produksi komersial karena mengharuskan adanya proses purifikasi. Maka dari itu, untuk meningkatkan efisiensi proses perlu dilakukan rekayasa genom Pichia pastoris dengan memasukkan salinan tambahan kaset ekspresi gen Kex2 sehingga jumlah Kex2 protease mencukupi untuk proses pematangan insulin glargine. Perbanyakan Kex2 dilakukan dengan proses transformasi genetik. Transformasi genetik merupakan suatu proses perpindahan gen dari satu organisme ke organisme lain dengan tujuan memunculkan karakteristik yang diinginkan. Plasmid rekombinan pPIC9K-Kex2 akan ditransformasikan ke Pichia pastoris GS115 dengan metode elektroporasi. Metode ini menggunakan medan listrik untuk menciptakan rongga semipermeabel pada sel inang. Plasmid pPIC9K-Kex2 masuk ke dalam sel Pichia pastoris GS115 melalui rongga semipermeabel tersebut dan pPIC9K-Kex2 berintegrasi dengan DNA genom. Adapun tujuan transformasi ini yaitu untuk mengetahui proses transformasi plasmid rekombinan pPIC9K-Kex2 ke Pichia pastoris galur GS115 dengan metode elektroporasi, mengkonfirmasi keberhasilan proses transformasinya, dan untuk mempersiapkan produksi protein insulin glargine pada penelitian selanjutnya. Penelitian ini dinyatakan berhasil karena sel transforman pada uji selektivitas antibiotik berhasil tumbuh di media yang mengandung antibiotik geneticin dengan konsentrasi 0,25 mg/ml dan 0,5 mg/ml. Adapun untuk analisis PCR, koloni tunggal yang berhasil tumbuh pada media seleksi diisolasi untuk didapatkan DNA genomnya. Setelah itu dilakukan PCR dengan primer Kex2-Fw dan primer Kex2-Rev, serta elektroforesis gel agarosa 1% untuk mengonfirmasi keberadaan gen Kex2 yang telah berhasil diintegrasi. Berdasarkan uji tersebut, diperoleh empat koloni tunggal positif yang berhasil membawa plasmid rekombinan pPIC9K-Kex2 dengan ukuran 11.626 bp.

English Abstract

SUMMARY Insulin glargine is an insulin analog designed to be absorbs quickly by the body and works together with natural human insulin. Insulin glargine is produced through genetic engineering and genetic transformation. The host cell used to produce insulin is Pichia pastoris. Pichia pastoris is yeast that often used as genetic transformation host cell for the purpose to express recombinant protein. In production of insulin glargine protein, Kex2 protease plays important role in maturation of the protein. Pratiwi et al. in 2022 revealed that the Kex2 gene increased the level of protein secretion and processed preproproteins into mature proteins. However, natural Kex2 protease produced by Pichia pastoris does not sufficient to mature the insulin glargine protein. This caused additional process in insulin glargine production such as trypsin treatment to mature the insulin precursor into two chains which produced impurities in the form of lysine and arginine residues and added the cost of commercial production because it required purification process. Therefore, to increase the process efficiency, it is necessary to modify the Pichia pastoris genome by inserting additional copies of the Kex2 gene expression cassette so that the amount of Kex2 protease is sufficient for insulin glargine maturation process. Kex2 propagation was carried out by a genetic transformation process. Genetic transformation is a process of transferring genes from one organism to another with the aim of bringing out the desired characteristics. The recombinant plasmid pPIC9K-Kex2 transformed to Pichia pastoris GS115 by electroporation method. This method used an electric field to create a semipermeable cavity in the host cell. The pPIC9K-Kex2 plasmid entered Pichia pastoris GS115 cells through the semi-permeable cavity and pPIC9K-Kex2 integrated with genomic DNA. The purpose of this transformation are to determine the transformation process of the recombinant plasmid pPIC9K-Kex2 to Pichia pastoris GS115 strain using the electroporation method, to confirm the success of the transformation process, and to prepare for the production of insulin glargine protein in future studies. This study was declared successful because the transformant cells in the antibiotic selectivity test managed to grow in media containing antibiotic geneticin at 0.25 mg/ml and 0.5 mg/ml concentration. As for PCR analysis, single colonies that successfully grew on selection media were isolated to obtain their genomic DNA. After that, PCR was performed with Kex2-Fw and Kex2-Rev primers, as well as 1% agarose gel electrophoresis to confirm the existence of Kex2 gene which had been successfully integrated. Based on the test, four positive single colonies were obtained successfully carried the recombinant plasmid pPIC9K-Kex2 with 11,626 bp size.

Item Type:	Thesis (Sarjana)
Identification Number:	052310
Uncontrolled Keywords:	Elektroporasi, Elektroforesis Gel Agarosa, Kex2, PCR, Pichia pastoris, pPIC9K, Transformasi
Divisions:	Fakultas Teknologi Pertanian > Teknologi Industri Pertanian
Depositing User:	Unnamed user with username saputro
Date Deposited:	16 Jan 2024 02:49
Last Modified:	16 Jan 2024 02:49
URI:	http://repository.ub.ac.id/id/eprint/210709

Text (DALAM MASA EMBARGO) Vina Fadriana Dewi.pdf Restricted to Registered users only until 31 December 2025. Download (2MB)

Actions (login required)

View Item