Kloning, Ekspresi, dan Purifikasi Protein Rekombinan L-arabinose isomerase dari Isolat Bakteri Arthrobacter psychrolactophilus

Firdausa, Salsabila and Dr. Ir. Yusuf Wibisono,, S.TP., M.Sc, IPM and Fina Amreta Laksmi,, S.TP., M.Sc., Ph.D (2023) Kloning, Ekspresi, dan Purifikasi Protein Rekombinan L-arabinose isomerase dari Isolat Bakteri Arthrobacter psychrolactophilus. Sarjana thesis, Universitas Brawijaya.

Abstract

RINGKASAN D-Tagatosa merupakan gula langka dengan banyak manfaat di berbagai sektor industri yang telah terintegrasi oleh Generally Recognize of Safe (GRAS) dari Food Drug Administrations (FDA). Gula ini dapat diproduksi dari galaktosa melalui proses enzimatis menggunakan enzim rekombinan L-arabinose isomerase (L-AI). Enzim ini dikode oleh gen araA yang dimiliki berbagai bakteri prokariotik, salah satunya bakteri Arthrobacter psychrolactophilus. Selain karena bakteri ini masih dalam satu genom dengan beberapa bakteri yang diketahui mengkode gen araA seperti Arthrobacter chlorophenolicus dan Arthrobacter globiformis, bakteri ini juga berhasil menghasilkan enzim rekombinan Dallulose epimerase yang memiliki stabilitas pada suhu yang tinggi. Pada penelitian ini, akan dilakukan kloning menggunakan In-Fusion® HD Cloning Kit, dilanjutkan dengan tahapan ekspresi menggunakan bakteri E. coli BL21 Star (DE3) sebagai host ekspresi dan pET28a(+) sebagai vektor ekspresi. Selanjutnya, sebelum dilakukan uji aktivitas, L-AI yang dihasilkan perlu dipurifikasi dengan metode Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) dan Ion Exchange Chromatography (IEC). Selain itu, Size Exclusion Chromatography (SEC) juga dilakukan untuk mengetahui berat molekul dari LAI yang dihasilkan. Berdasarkan pengujian menggunakan metode PCR dan sekuensing, tahapan kloning berhasil dilakukan. Hasil ekspresi dan purifikasi dikonfirmasi menggunakan metode SDS-Page dan Western blot dengan diketahui berat molekul monomer enzim ialah 56 kDa. Sedangkan berat molekul native enzim ialah 295,12 kDa dengan bentuk nativenya ialah pentamer. Selain itu, jumlah protein yang didapatkan dalam sekali produksi (400 mL) ialah 387,526 ng untuk sampel crude enzim; 66,165 ng untuk sampel hasil purifikasi IMAC, dan 14,912 ng untuk sampel hasil purifikasi IEC. Diperlukan pengujian aktivitas enzim untuk mengetahui kondisi dan aktivitas optimal dari L-AI yang dihasilkan.

English Abstract

SUMMARY D-Tagatosa is a rare sugar with numerous benefits in various industrial sectors and has been recognized as Generally Recognized as Safe (GRAS) approved by Food and Drug Administration (FDA). This sugar can be produced from galactose through an enzymatic process using recombinant L-arabinose isomerase (L-AI) enzyme. This enzyme is encoded by the araA gene found in various prokaryotic bacteria, including Arthrobacter psychrolactophilus. In previous study, this bacterium has also been successful in producing recombinant D-allulose epimerase enzyme which has stability at high temperatures. In this study, cloning will be performed using the In-Fusion® HD Cloning Kit, followed by the expression stage using E. coli BL21 Star (DE3) as the expression host and pET28a(+) as expression vector. Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) dan Ion Exchange Chromatography (IEC) methods are employed for purification, while Size Exclusion Chromatography (SEC) determine the molecular weight of the resulting LAI. Successful cloning steps were confirmed through PCR and sequencing methods. Expression and purification results were validated using SDS-Page and western blot methods, revealing that the molecular weight of monomer enzyme is 56 kDa. While the molecular weight of native enzyme is 295,12 kDa and exists in pentameric form. Furthermore, the total protein obtained from a single production (400 mL) was 387.526 ng for crude enzyme samples, 66.165 ng for IMAC purification samples, and 14.912 ng for IEC purification samples. Further enzyme activity testing is necessary to determine the optimal conditions and activity of the produced L-AI.

Item Type:	Thesis (Sarjana)
Identification Number:	052310
Uncontrolled Keywords:	L-arabinose isomerase, Arthrobacter psychrolactophilus, Kloning, Ekspresi, Purifikasi
Divisions:	Fakultas Teknologi Pertanian > Teknologi Industri Pertanian
Depositing User:	Unnamed user with username saputro
Date Deposited:	15 Jan 2024 04:02
Last Modified:	15 Jan 2024 04:02
URI:	http://repository.ub.ac.id/id/eprint/209987

Text (DALAM MASA EMBARGO) Salsabila Firdausa.pdf Restricted to Registered users only until 31 December 2025. Download (6MB)

Actions (login required)

View Item