Artha, Ayu Desi (2018) Optimalisasi Metode Isolasi DNA dari Sampel Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) Pasien Triple Negative Breast Cancer untuk Next-Generation Sequencing. Sarjana thesis, Universitas Brawijaya.
Abstract
Rendahnya kualitas dan kuantitas DNA FFPE masih menjadi kendala dalam setiap analisis menggunakan Next-Generation Sequencing (NGS). Tujuan penelitian ini yaitu untuk menentukan jumlah input sampel FFPE, cara deparafinasi dan waktu inkubasi yang optimal menggunakan QIAamp DNA FFPE Kit dan GeneRead DNA FFPE Kit untuk mendapatkan isolat DNA FFPE yang sesuai dengan standar peruntukan NGS. Penelitian ini dilakukan selama 6 bulan (Februari – Juli 2018) di Laboratorium Stem Cell and Cancer Institute (SCI), Kalbe Farma Tbk., Jakarta Timur. Sampel FFPE berasal dari arsip pasien kanker payudara RS. Dharma Nugraha dan telah disetujui oleh komite etik SCI. Perlakuan yang diberikan meliputi jumlah input sampel 3 x 10 μm dan 6 x 10 μm, metode deparafinasi di slide glass dan microtube, dan variasi waktu inkubasi dalam Proteinase-K pada suhu 56 ºC selama 1 jam, 4 jam, dan 16 jam. Parameter yang diukur dalam penelitian ini adalah konsentrasi dsDNA dengan target sebesar 25 ng/μL, diukur dengan Qubit Fluorometer. Integritas DNA diuji dengan quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) menggunakan SYBR Green I dyes, sampel dengan nilai kuantifikasi (ΔCq) ≤ 2 dapat digunakan untuk proses library preparation untuk NGS. DNA diamplifikasi menggunakan AFP2 custom amplicon design yang ditujukan untuk BRCA1/2 germline assay. Produk PCR dengan ukuran ~350 bp menunjukkan kualitas DNA yang baik untuk disekuensing. Hasil penelitian menunjukkan bila jumlah input sampel FFPE sebanyak 6 x 10 μm, metode deparafinasi di slide glass, dan waktu inkubasi 4 jam dalam Proteinase-K pada suhu 56ºC merupakan kondisi optimum untuk mendapatkan isolat DNA yang dibutuhkan untuk NGS. Kapabilitas Kit QA dan Kit GR untuk isolasi DNA tidak berbeda signifikan.
English Abstract
The low quality and quantity of DNA FFPE is still an obstacle in every analysis using Next-Generation Sequencing (NGS). This study to determine the number of FFPE sample input, optimal deparaffination method and incubation time using QIAamp DNA FFPE Kit (QA) and GeneRead DNA FFPE Kit (GR) to obtain the appropriate DNA FFPE isolates for NGS. This study was conducted for 6 months (February - July 2018) at the Stem Cell and Cancer Institute (SCI) Laboratory, Kalbe Farma Tbk., East Jakarta. The FFPE samples are obtained from Dharma Nugraha Hospital breast cancer patients archives and has been approved by the SCI ethics committee. The method involving variation of input number of FFPE samples (3 x 10 μm dan 6 x 10 μm), deparaffinization on the slide glass and microtube, and enzyme digestion 1 hour, 4 hours and 16 hours using proteinase-K at 56ºC. The parameters measured in this study are dsDNA concentration in 25 ng/μL as a target, measured by Qubit Fluorometer. DNA integrity was measured by quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) using SYBR Green I dyes, samples with quantification values (ΔCq) ≤ 2 can be selected to library preparation process for NGS assay. DNA was amplified using AFP2 custom amplicon design intended for BRCA1/2 germline assay. Expected PCR product from library preparation ~ 350 bp showed good DNA quality for sequencing using NGS. The optimum condition to extract DNA FFPE from the samples that ware deparaffinized on the slide glass, digested for 4 hours in Proteinase- K at 56ºC with 6 x 10 μm input number of FFPE samples. QA kit capabilities have no significantly different from GR Kit.
| Item Type: | Thesis (Sarjana) |
|---|---|
| Identification Number: | SKR/MIPA/2018/482/051900411 |
| Uncontrolled Keywords: | Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded, isolasi DNA, Next- Generation Sequencing, qPCR, Qubit DNA isolation, Formalin-Fixed Paraffin-Embedded, Next-Generation Sequencing, qPCR, Qubit |
| Subjects: | 600 Technology (Applied sciences) > 616 Diseases > 616.9 Other disease > 616.99 Tumors and miscellaneous communicable diseases > 616.994 Cancers > 616.994 49 Breast cancer |
| Divisions: | Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam > Biologi |
| Depositing User: | Budi Wahyono Wahyono |
| Date Deposited: | 05 Jun 2020 07:12 |
| Last Modified: | 18 Oct 2021 06:48 |
| URI: | http://repository.ub.ac.id/id/eprint/168786 |
Preview |
Text
Ayu Desi Artha (2).pdf Download (1MB) | Preview |
Actions (login required)
 |
View Item |