Identifikasi Kapang Patogen dan Kapang Antagonis pada Tanaman Apel Berdasarkan Sekuen 18S rDNA, ITS dan RPB1

Lestari, FitriaWahyu (2013) Identifikasi Kapang Patogen dan Kapang Antagonis pada Tanaman Apel Berdasarkan Sekuen 18S rDNA, ITS dan RPB1. Magister thesis, Universitas Brawijaya.

Abstract

Kapang patogen merupakan salah satu penyebab penyakit busuk akar dan batang serta kematian pada tanaman apel. Salah satu upaya pengendalian secara hayati serangan kapang patogen dapat dilakukan dengan kapang antagonis. Upaya identifikasi strain kapang patogen dan kapang antagonis secara tepat diharapkan dapat mendukung upaya pengendalian serangan kapang patogen. Identifikasi dapat dilakukan secara konvensional (secara fenotipik) dan didukung dengan identifikasi secara molekular sehingga diperoleh hasil yang akurat. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi nama strain Pythium splendens kapang patogen tanaman apel di Kota Batu, mengidentifikasi isolat kapang antagonis secara molekular yang diduga termasuk dalam spesies Trichoderma hingga tingkat strain, mengetahui hubungan kekerabatan masing-masing isolat kapang patogen dan kapang antagonis berdasarkan sekuen 18S rDNA, ITS, dan RPB1 serta membandingkan hasil identifikasi isolat-isolat tersebut secara molekular dengan penggunaan primer yang berbeda untuk 18S rDNA, ITS, dan RPB1. Identifikasi secara fenotipik telah diperoleh dari penelitian sebelumnya, sedangkan identifikasi secara molekular dilakukan dalam penelitian ini. Adapun tahapan dalam identifikasi secara molekular meliputi subkultur dan pemurnian monospora kapang patogen (isolat M1, M4 dan MB1) pada media Jungle Juice Agar dan kapang antagonis (isolat Trichoderma sp. 1, Trichoderma sp. 4 dan Trichoderma sp. 6) pada media PDA ( Potato Dextrose Agar ). Isolasi DNA kapang patogen dan kapang antagonis dilakukan setelah koloni kapang ditumbuhkan pada media cair ( Potato Dextrose Broth ) selama tiga sampai empat hari pada suhu 30 o C dengan kecepatan 120 rpm. Hasil isolasi DNA diamplifikasi menggunakan primer NS1/NS8 untuk memeroleh sekuen 18S rDNA, primer ITS4/ITS5 untuk memeroleh sekuen ITS dan primer RPB1 Af, Ac/RPB1 Cr untuk memeroleh sekuen RPB1. Amplikon masing-masing isolat dipurifikasi dan disekuensing. Data sekuen yang diperoleh dianalisis menggunakan program MEGA Ver. 5.03 untuk konstruksi pohon filogeni dan penentuan jarak evolusi dari masing-masing isolat dengan isolat acuan dari GenBank, program MVSP Ver. 3.22 untuk analisis PCA ( Principle Component Analysis ) dan program DnaSP ( DNA Sequence Polymorphism ) Ver. 5.10.01 untuk analisis polimorfisme ( singleton dan parsimony informative ). Analisis fenotipik juga dilakukan untuk mendukung data hasil analisis filogenetik. Karakter yang digunakan untuk analisis diperoleh dari penelitian sebelumnya (Nugrahani dkk., 2012) menggunakan program NTSYSpc Ver. 2.02i. Kapang patogen (M1, M4 dan MB1) berdasarkan sekuen 18S rDNA merupakan Py. splendens 117 tetapi tidak dapat ditentukan strainnyaberdasarkan sekuen ITS dan RPB1. Namun, strain kapang antagonis ( Trichoderma sp.1, Trichoderma sp.4 dan Trichoderma sp.6) menunjukkan hasil determinasi yang tidak konsisten. Berdasarkan sekuen 18S rDNA, isolat Trichoderma sp.1 dan Trichoderma sp.4 termasuk dalam spesies T. viride dan Trichoderma sp.6 termasuk dalam spesies T. harzianum dan T. longibrachiatum , sementara dengan menggunakan sekuen ITS isolat-isolat tersebut termasuk dalam spesies T. asperellum untuk isolat Trichoderma sp.1 dan Trichoderma sp.4 dan T. harzianum untuk Trichoderma sp.6, sedangkan berdasarkan sekuen RPB1 isolat-isolat tersebut tidak dapat ditentukan spesiesnya. Hal ini menunjukkan isolat kapang patogen M1, M4 dan MB1 memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dan termasuk satu strain yang sama, sedangkan isolat kapang patogen Trichoderma sp.1 dan Trichoderma sp.4 dimungkinkan memiliki hubungan kekerabatan yang lebih dekat dibandingkan dengan isolat Trichoderma sp.6. Hasil analisis menunjukkan sekuen 18S rDNA dan ITS dapat mendeterminasikan isolat kapang patogen dan kapang antagonis lebih baik dibandingkan dengan sekuen RPB1.

English Abstract

Pathogenic fungi are organism that causes diseases and death on apple crop. Biological control for fungi can be done by applying ir antagonistic fungi, so strain identification of pathogenic fungi and antagonistic fungi are expected to support effort of control of pathogenic fungi and support bio fungicide production. Characterization of fungi using morphological and molecular identification are expected to produce accurate result. objectives of this study were identify strains of pathogenic fungi Pythium splendens that attacked apple plant in Batu City, identify strains of antagonistic fungi, know phylogenetic relationship of pathogenic fungi and antagonistic fungi based on 18S rDNA, ITS and RPB1 sequences and compare phylogenetic identification result using different sequences. Morphological data have been obtained from previous studies, whereas molecular identification will be carried out in this study. stages in this study consist of monospore subculture of pathogenic fungi (M1, M4 and MB1) on Jungle Juice medium and antagonistic fungi ( Trichoderma sp. 1, Trichoderma sp. 4 and Trichoderma sp. 6) on PDA medium (Potato Dextrose Agar). genomes of fungi were isolated after fungi colonies were grown in liquid medium (Potato Dextrose Broth) at 30 o C with 120 rpm. Polimerase Chain Reaction (PCR) was done using several primers for three molecular markers: 18S rDNA (NS1/NS8), ITS (ITS4/ITS5) and RPB1 (RPB1 Af, Ac/RPB1 Cr). Amplicons from each isolate was purified and sequenced. Analysis of DNA sequence was done using MEGA ver. 5.03 program to construct phylogeny tree and evolutionary distance using reference isolates from GenBank, using MVSP ver. 3.22 program to analysis PCA (Principle Component Analysis) and DnaSP ver. 5.10.01to analysis polymorphism (singleton and parsimony-informative). Phenotypic variation was analyzed using dendogram which was constructed using NTSYSpc ver. 2.01i program to support phylogenetic identification. pathogenic fungi (M1, M4 and MB1) were determined as Pythium splendens 117 using18S rDNA sequence, but o r sequences (ITS and RPB1) were unable to determine m. However, inconsistence determination result of antagonistic fungi ( Trichoderma sp.1, Trichoderma sp.4 and Trichoderma sp.6) were showed by sequences of 18S rDNA, ITS and RPB1. Based on 18S rDNA Trichoderma sp.1 and Trichoderma sp.4 had relationship with T. viride and Trichoderma sp.6 had relationship with T. Harzianum and T. longibrachiatum, on o r hand using ITS sequences, Trichoderma sp.1 and Trichoderma sp.4 had relationship with T. asperellum and Trichoderma sp.6 constantly had relationship with T. harzianum using both molecular marker. Pathogenic fungi isolates M1, M4 and MB1 have close relationship and grouped into same strain, whereas antagonistic fungi Trichoderma sp.1 possibly have a closer relationship to Trichoderma sp.4 compared to relationship between both fungi to Trichoderma sp.6. data analysis showed 18S rDNA and ITS sequences can determine pathogenic fungi and antagonistic fungi better than RPB1 sequences.

Item Type: Thesis (Magister)
Identification Number: TES/634.11/LES/i/041308725
Subjects: 600 Technology (Applied sciences) > 634 Orchards, fruits, forestry > 634.1 Pomaceous fruits
Divisions: S2/S3 > Magister Biologi, Fakultas MIPA
Depositing User: Endro Setyobudi
Date Deposited: 21 Feb 2014 12:58
Last Modified: 21 Feb 2014 12:58
URI: http://repository.ub.ac.id/id/eprint/158949
Full text not available from this repository.

Actions (login required)

View Item View Item