Azara, Rima (2013) Kloning dan Ekspresi Gen AnsZ yang Menyandi Enzim L-Asparaginase dari Bacillus subtilis Lokal. Magister thesis, Universitas Brawijaya.
Abstract
L-asparaginase merupakan enzim yang mampu menghidrolisis L-asparagin menjadi asam L-aspartat dan ammonia. Kemampuan ini dalam dunia medis digunakan sebagai kemoterapi bagi penderita leukemia terutama acute lymphoblastic leukemia (ALL). L-asparaginase yang dihasilkan oleh bakteri terdapat dua tipe yaitu tipe I dan tipe II. Sekuen asam amino B. subtilis AnsA mirip dengan sekuen L-asparaginase tipe I dari E. coli (EcAI), sedangkan L-asparaginase AnsZ dari B. subtilis mirip dengan sekuen L-asparaginase tipe II dari E. coli (EcAII). Penelitian mengenai L-asparaginase (AnsZ) belum pernah dilakukan, sehingga pada penelitian ini dilakukan subkloning gen penyandi L-asparaginase (AnsZ) dan mengekspresikannya ke dalam Escherichia coli. Penelitian ini bersifat eksploratif deskriptif. ORF (Open Reading Frame) dari L-asparaginase (AnsZ) diperoleh dengan melakukan kloning gen penyandi L-asparaginase (AnsZ) dari Bacillus subtilis dengan menggunakan vektor pGEM® -T Easy, sebagai sel inang yaitu E. coli DH5α. Pada tahapan subkloning dilakukan pemotongan pada insert (L-asparaginase AnsZ) maupun vektor pET 21d (+) menggunakan enzim yang sama yaitu NcoI dan SalI. Hasil transformasi pada E. coli DH5α yang positif kemudian disekuensing dan dilakukan retransformasi ke E. coli BL21 star. Plasmid rekombinan pET 21d (+) L-asparaginase (AnsZ) yang positif dari hasil subkloning kemudian digunakan untuk produksi enzim L-asparaginase (AnsZ). Enzim yang didapatkan kemudian dipurifikasi menggunakan HisPurTM Ni-NTA Purification Kit dan diuji aktivitasnya menggunakan metode Nessler. Hasil sekuensing pada proses kloning menunjukkan bahwa pGEM® - T Easy (AnsZ) klon 15 memiliki persentase kemiripan 99% dengan L-asparaginase dari Bacillus subtilis Bsn5, complete genome dan 99% dengan L-asparaginase (AnsZ) dari Bacillus subtilis subsp. Subtilis 6051-HGW, complete genome. Tahapan sub kloning menghasilkan plasmid rekombinan pET 21d (+) AnsZ klon 1.9. Hasil sekuensing pET 21d (+) AnsZ klon 1.9 memiliki persentase kemiripan 99% dengan L-asparaginase dari Bacillus subtilis Bsn5, complete genome dan 99% dengan L-asparaginase (AnsZ) dari Bacillus subtilis strain B11-06, complete cds. Aktivitas enzim L-asparaginase (AnsZ) dari E. coli yang mengandung plasmid rekombinan dengan open reading frame (ORF) L-asparaginase (AnsZ) dari Bacillus subtilis lebih tinggi daripada plasmid yang tidak mengandung ORF L-asparaginase (AnsZ). Purifikasi menggunakan HisPur TM Ni-NTA Purification Kit berhasil meningkatkan aktivitas spesifik dari enzim L-asparaginase (AnsZ) sebanyak 29 kali.
English Abstract
L-asparaginase merupakan enzim yang mampu menghidrolisis L-asparagin menjadi asam L-aspartat dan ammonia. Kemampuan ini dalam dunia medis digunakan sebagai kemoterapi bagi penderita leukemia terutama acute lymphoblastic leukemia (ALL). L-asparaginase yang dihasilkan oleh bakteri terdapat dua tipe yaitu tipe I dan tipe II. Sekuen asam amino B. subtilis AnsA mirip dengan sekuen L-asparaginase tipe I dari E. coli (EcAI), sedangkan L-asparaginase AnsZ dari B. subtilis mirip dengan sekuen L-asparaginase tipe II dari E. coli (EcAII). Penelitian mengenai L-asparaginase (AnsZ) belum pernah dilakukan, sehingga pada penelitian ini dilakukan subkloning gen penyandi L-asparaginase (AnsZ) dan mengekspresikannya ke dalam Escherichia coli. Penelitian ini bersifat eksploratif deskriptif. ORF (Open Reading Frame) dari L-asparaginase (AnsZ) diperoleh dengan melakukan kloning gen penyandi L-asparaginase (AnsZ) dari Bacillus subtilis dengan menggunakan vektor pGEM® -T Easy, sebagai sel inang yaitu E. coli DH5α. Pada tahapan subkloning dilakukan pemotongan pada insert (L-asparaginase AnsZ) maupun vektor pET 21d (+) menggunakan enzim yang sama yaitu NcoI dan SalI. Hasil transformasi pada E. coli DH5α yang positif kemudian disekuensing dan dilakukan retransformasi ke E. coli BL21 star. Plasmid rekombinan pET 21d (+) L-asparaginase (AnsZ) yang positif dari hasil subkloning kemudian digunakan untuk produksi enzim L-asparaginase (AnsZ). Enzim yang didapatkan kemudian dipurifikasi menggunakan HisPurTM Ni-NTA Purification Kit dan diuji aktivitasnya menggunakan metode Nessler. Hasil sekuensing pada proses kloning menunjukkan bahwa pGEM® - T Easy (AnsZ) klon 15 memiliki persentase kemiripan 99% dengan L-asparaginase dari Bacillus subtilis Bsn5, complete genome dan 99% dengan L-asparaginase (AnsZ) dari Bacillus subtilis subsp. Subtilis 6051-HGW, complete genome. Tahapan sub kloning menghasilkan plasmid rekombinan pET 21d (+) AnsZ klon 1.9. Hasil sekuensing pET 21d (+) AnsZ klon 1.9 memiliki persentase kemiripan 99% dengan L-asparaginase dari Bacillus subtilis Bsn5, complete genome dan 99% dengan L-asparaginase (AnsZ) dari Bacillus subtilis strain B11-06, complete cds. Aktivitas enzim L-asparaginase (AnsZ) dari E. coli yang mengandung plasmid rekombinan dengan open reading frame (ORF) L-asparaginase (AnsZ) dari Bacillus subtilis lebih tinggi daripada plasmid yang tidak mengandung ORF L-asparaginase (AnsZ). Purifikasi menggunakan HisPur TM Ni-NTA Purification Kit berhasil meningkatkan aktivitas spesifik dari enzim L-asparaginase (AnsZ) sebanyak 29 kali.
| Item Type: | Thesis (Magister) |
|---|---|
| Identification Number: | TES/579.362/a/KLO/041401665 |
| Subjects: | 500 Natural sciences and mathematics > 579 Natural history of microorganisms, fungi, algae > 579.3 Prokaryotes |
| Divisions: | S2/S3 > Magister Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian |
| Depositing User: | Hasbi |
| Date Deposited: | 07 Apr 2014 11:16 |
| Last Modified: | 07 Apr 2014 11:16 |
| URI: | http://repository.ub.ac.id/id/eprint/157731 |
Actions (login required)
 |
View Item |