Mulyati, Yayuk (2009) Studi Mutasi Berdasarkan Pola Fragmen Restriksi Gen PARP-1 (Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1) Exon 21 dan 23 Menggunakan PCR-RFLP pada Mencit Jantan Balb-c yang Terpapar Formalin. Magister thesis, Universitas Brawijaya.
Abstract
Gen PARP-1 merupakan salah satu gen yang terlibat dalam perbaikan DNA dan respon sel lainnya yang berkaitan dengan kerusakan DNA. Meskipun sel memiliki kemampuan perbaikan, yaitu salah satunya melalui PARP-1 , akan tetapi kehadiran agen genotoksik mampu mempengaruhi kerja gen ini. Formalin merupakan salah satu senyawa kimia yang bersifat mutagenik dan genotoksik. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui ada tidaknya mutasi berdasarkan pola fragmen restriksi gen PARP- 1 pada exon 21 dan exon 23 menggunakan PCR-RFLP pada mencit jantan Balb-c yang terpapar formalin. Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental. Mencit Balb-c jantan berumur 2 bulan dipapar formalin pada dosis 0 mg/kg BB, 2 mg/kg BB, dan 5 mg/kg BB selama 3 bulan. Pada minggu ke-14 dilakukan pembedahan mencit yang diikuti dengan pengambilan organ hepar. DNA hepar diisolasi dengan menggunakan NucleoSpin Kit. Hasil isolasi DNA kemudian diamplifikasi dengan menggunakan dua primer, yaitu primer PARP21: forward 5`CCATGGTATTATGACACGGGA3`, reverse 5`GGAATGGTACTGTTGTAGGCT3`, untuk mengenali exon 21 dan primer PARP23: forward 5`TTTTTAGCTCAAAATAAATGCTTAA3`, reverse 5`GTTGTTTGTGGTTTGTCCTA3` untuk mengenali exon 23. Produk amplifikasi kemudian dipotong dengan menggunakan enzim Alu 1, Hae III, Hin dIII, dan Eco R1. Analisis ada tidaknya mutasi pada gen PARP 1 exon 21 dan exon 23 dilakukan dengan membandingkan pola fragmen restriksi antar kelompok perlakuan. Peubah lain yang diukur dalam penelitian ini adalah perubahan berat badan dan kondisi klinis mencit. Hasil penelitian menunjukkan bahwa paparan formalin pada dosis 0 mg/kg BB, 2 mg/kg BB, dan 5 mg/kg BB belum terbukti memberikan efek mutasi terhadap gen PARP-1 exon 21 dan exon 23 yang dikaji melalui teknik PCR-RFLP. Belum terbukti adanya mutasi gen PARP-1 exon 21 dan exon 23 didasarkan pada beberapa alasan. Pertama, hasil amplifikasi gen PARP1 exon 21 dan exon 23 menunjukkan pola pita amplifikasi yang sama antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan, yaitu masing-masing menghasilkan produk amplifikasi berturut-turut sekitar 250 bp dan 350 bp. Kesamaan pola pita hasil amplifikasi menunjukkan bahwa sekuen gen PARP-1 kelompok perlakuan tidak mengalami perubahan (terutama pada daerah yang dikenali primer), sehingga primer dapat mengenali DNA template dari kelompok kontrol. Belum terbukti adanya mutasi pada gen PARP-1 exon 21 dan exon 23 terkait dengan hasil amplifikasi didasarkan pada salah satu prinsip kerja PCR, yaitu annealing . Proses annealing hanya terjadi apabila terdapat kecocokan basa nukleotida antara basa-basa nukleotida pada primer dengan basa-basa nukleotida pada DNA template. Alasan kedua, pemotongan gen PARP 1 exon 21 dengan Alu 1 menghasilkan dua fragmen restriksi dengan pola yang sama, yaitu berukuran sekitar 50 bp dan 300 bp; sementara itu, pemotongan gen PARP 1 exon 23 juga menghasilkan dua fragmen restriksi dengan pola yang sama, yaitu sekitar 50 bp dan 200 bp. Hasil pemotongan yang sama dapat diartikan bahwa sekuen pengenalan Alu 1 tidak mengalami perubahan, sehingga pemotongan dengan enzim tersebut dapat menghasilkan pola fragmen yang sama. Klarifikasi ada tidaknya mutasi pada gen PARP 1 exon 21 dan exon 23 dilakukan dengan memotong kedua exon tersebut dengan Ha eIII, Hin dIII, dan Eco R1. Pemotongan dengan ketiga enzim tersebut menunjukkan hasil yang sama, yaitu tidak terbentuk fragmen restriksi dan posisi pita DNA PARP-1 exon 21 dan exon 23 secara berturut-turut tetap berada pada ukuran sekitar 350 bp dan 250 bp, sesuai dengan hasil amplifikasi. Klarifikasi dilakukan mengingat sifat mutasi yang acak, kebetulan, dan tidak terarah. Selain belum terbukti menyebabkan efek mutasi pada gen PARP 1 exon 21 dan exon 23, perlakuan paparan formalin juga tidak menyebabkan terjadinya penurunan berat badan dan pada kelompok paparan 5 mg/kg BB menyebabkan timbulnya beberapa penyimpangan morfologis, antara lain yaitu iritasi kelopak mata, kaki mengalami iritasi, bengkak, dan pincang, rambut punggung berdiri dan rontok, serta inflamasi lokal pada bagian leher. Penyimpangan-penyimpangan tersebut diduga berkaitan dengan efek metabolik asidosis yang memicu pembentukan radical oxygen species . Radikal spesies tersebut pada gilirannya dapat memicu berbagai gangguan sistem imun inang. Berdasarkan hasil observasi klinis pada perlakuan paparan 5 mg/kg BB yang menemukan adanya beberapa penyimpangan morfologi, sementara kajian genetis melalui teknis PCR-RFLP belum terbukti menunjukkan adanya mutasi, maka pada penelitian berikutnya disarankan untuk: a) melakukan sekuensing untuk memastikan ada tidaknya mutasi pada exon 21 dan exon 23; b) melakukan evaluasi terhadap exon gen PARP-1 lainnya guna memastikan aman tidaknya dosis yang selama ini dikatakan sebagai acceptable daily intake formalin oleh WHO; dan c) melakukan kajian efek paparan formalin terhadap gen PARP-1 yang terdapat pada ginjal dan paru-paru, karena keduanya juga merupakan jalur eliminasi formalin.
English Abstract
Gene PARP-1 is one of gene that involved in DNA repair and the other mechanism related with DNA damage. The activity of PARP1 in repair mechanism is influenced by genotoxic agent. Formaldehyde is one of mutagenic and genotoxic chemical compounds. The objective of this experiment was to identify whether there is mutation based on restriction fragment of gene PARP 1 exon 21 and exon 23 using PCR-RFLP on male Mus musculus Balb-c after formaldehyde exposure. This research was experimental research with four replicates. Male Mus musculus Balbc was exposure with formaldehyde for three months in three doses, i.e. 0 mg/kg BW, 2 mg/kg BW, and 5 mg/kg BW. Animal was sacrificed on the third month. DNA was isolated from hepar with NucleoSpin Kit. After isolation, the DNA was amplifying with 2 primers, i.e. primer PARP21: forward 5`CCATGGTATTATGACACGGGA3`, reverse 5`GGAATGGTACTGTTGTAGGCT3 to recognize exon 21; and primer PARP23: forward 5`TTTTTAGCTCAAAATAAATGCTTAA3`, reverse 5`GTTGTTTGTGGTTTGTCCTA3`, to recognize exon 23. Product of amplification is digested with Alu 1, Hae III, Hin dIII, and Eco R1. Analysis whether there is mutation in PARP 1 exon 21 and exon 23 was conducted by comparing the restriction fragment pattern between treatment groups. The study showed that formaldehyde exposure has not been proven yet giving mutation effect on PARP 1 exon 21 as well as exon 23 through PCR-RFLP analysis. This result is based on many reasons that will be described further. First, amplification product of PARP 1 exon 21 and exon 23 between control and treatment groups has similarity on amplification band pattern, which the size amplification of each exon is about 250 bp and 350 bp, respectively. With those similarities, it can be said that there is no alteration of PARP 1 gene, especially on exon 21 and exon 23 of treatment groups, so the primer can recognize it. Based on PCR theory, annealing process can be conducted if there are complementary between primer nucleotide and DNA template nucleotide. The second reasons is based on the digestion result. Digestion of PARP 1 exon 21 and exon 21 with Alu 1 resulting two restriction fragments with the same pattern in all treatment groups, i.e. about 50 bp and 300 bp; on the other hands, digestion PARP 1 exon 23 resulting two restriction fragments with the same pattern too, i.e. about 50 bp and 200 bp. From those result, it can be said that recognition sequences of Alu1 on exon 21 and exon 23 weren`t changed. To clarify whether there is mutations in PARP 1 exon 21 and exon 23; both exon was digest with the other enzymes, i.e. Hae III, Hind III, and Eco R1. Digestion with those enzymes showed that there is no fragment digest formation and the band position of PARP 1 exon 21 and exon 23 respectively are about 350 bp and 250 bp, this is suitable with amplification result. Clarification was done because mutation is genetic process that has characteristic random and unpredictable. Result experiment also found that there is no decreasing of Mus musculus body weight after formaldehyde exposure. Formaldehyde exposure on dose 5 mg/kg BW resulting many morphology abnormality, i.e. conjunctivites, foot irritation, back hair fall, and local inflammatory. This disorder suggested related with effect of acidosis metabolic that trigger radical oxygen species generation. Further, this species radical can influence the immune system of host. Based on those result, there are many recommendations for the next research, i.e. a) do the sequencing to make sure whether there is mutations in gene PARP-1 exon 21 and exon 23; b) evaluate to the other exon of gene PARP1 to make sure the safety of those doses that states as acceptable daily intake of formalin by WHO; c) study the effect of formaldehyde exposure to the gene PARP-1 on kidney and lung because both organs is involved in formaldehyde elimination pathways.
| Item Type: | Thesis (Magister) |
|---|---|
| Identification Number: | TES/576.549/MUL/s/040902895 |
| Subjects: | 500 Natural sciences and mathematics > 576 Genetics and evolution > 576.5 Genetics |
| Divisions: | S2/S3 > Magister Matematika, Fakultas MIPA |
| Depositing User: | Endro Setyobudi |
| Date Deposited: | 19 Mar 2014 09:28 |
| Last Modified: | 19 Mar 2014 09:28 |
| URI: | http://repository.ub.ac.id/id/eprint/157711 |
Actions (login required)
 |
View Item |